基于生物信息学分析γ-谷氨酰转移酶5在肝癌中的表达和意义

杨麒臻, 牛玉林, 陈 乾

(贵州医科大学附属医院 器官移植科, 贵州 贵阳, 550000)

肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝脏肿瘤,但HCC发展的分子机制尚不清楚[1-2]。尽管HCC靶向治疗取得了实质性进展,但既往研究[3-4]表明,大多数HCC患者在相对较短的时间内对靶向药物产生获得性耐药。HCC细胞和肿瘤微环境的相互作用为研究HCC发展和转移的分子机制提供了新的方向[5-6]。然而, HCC致癌的分子驱动因素尚不清楚。在目前的HCC治疗中,仍然缺乏用于早期诊断或用作HCC潜在治疗靶点的特定生物标志物。作为参与细胞外谷胱甘肽代谢的关键肝酶,γ-谷氨酰转移酶可以切割谷胱甘肽以维持人体中的谷胱甘肽平衡[7-8]。γ-谷氨酰转移酶5(GGT5)是迄今为止已确定的具有催化活性的2个GGT家族成员(GGT1和GGT5)之一, GGT5广泛分布于多种组织中,在肝脏、肾脏和肺泡巨噬细胞中的表达相对较高,参与细胞生长发育中的许多功能,例如调节基因表达和药物敏感性。

GGT5蛋白的异常表达已被证明对胃癌和胰腺癌的恶性进展有显著影响,为确定肿瘤药物靶点提供了理论依据[9-10]。本研究利用多个生物数据库和多种实验方法分析GGT5在HCC中的差异表达及其与临床病理参数的关系,本研究还应用基因本体(GO)注释、京都基因和基因组百科全书(KEGG)来探索GGT5在HCC中的潜在功能,而HCC细胞的免疫浸润是HCC发病的重要原因,因此本研究还探讨了HCC免疫微环境中免疫细胞与GGT5表达的相关性,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 癌症基因组图谱(TCGA)数据库

使用UCSC Xena浏览器从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下载GGT5的转录组数据和临床信息,其中包含375例HCC患者和50个癌旁组织。利用RSEM程序(v1.3.3)将转录组数据组织成基因表达基础文件,利用R程序(v4.3.6)提取每组样品中GGT5的表达数据。P<0.05为差异有统计学意义。

1.2 UALCAN 数据库

UALCAN是一个允许在线分析TCGA数据的临床病理学特征的网站(http://ualcan.path.uab.edu), 本研究使用UALCAN比较GGT5与不同临床病理特征(如肿瘤分级、分期、患者年龄、种族和肿瘤分子亚型)、基因表达的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

1.3 人类蛋白质图谱(HPA)

HPA数据库是基于蛋白质组学检测的人类多种蛋白质的表达。本研究比较了HPA数据库中GGT5在肝脏和HCC组织中的蛋白表达。

1.4 Linked Omics数据库

Linked Omics数据库是一个多组学网站(http://www.linkedomics.org/login.php), 可以分析TCGA数据集中的33种肿瘤的多组学分析。本研究通过Link Finder模块查询了HCC中GGT5相关差异表达的基因。通过皮尔逊相关系数分析与GGT5呈正、负相关的基因,并使用火山图和热图可视化这些不同的基因。为了进一步探索GGT5可能参与的生物学功能,对这些基因进行了GO分析和KEGG途径富集分析。

1.5 肿瘤免疫(TIMER)分析

TIMER是一个在线网站(https://cistrome.shinyapps.io/timer/), 用于分析不同肿瘤中的肿瘤细胞的免疫浸润。为了研究GGT5和HCC细胞的免疫浸润的关系,本研究通过TIMER算法估计了HCC细胞中免疫细胞的浸润丰度,包括B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突状细胞(DC)。

1.6 逆转录定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)

从上海中桥新洲生物技术有限公司购买了人正常肝上皮细胞系(LO2)和人肝癌细胞系(Hep G2、Hep 3B、97H和LM3), 并在Dulbecco的改良培养基的细胞中培养。在生长状态良好的肝细胞和肝癌细胞中加入TRIzol试剂后常规提取总RNA, 并测定RNA浓度。随后将1 μg的RNA逆转录为cDNA, 将逆转录得到的cDNA用无RNase水稀释10倍后作为模版进行qRT-PCR检测, qRT-PCR的试验使用SYBR®Green荧光定量试剂盒。扩增的条件为95 ℃持续10 min, 95 ℃持续15 s, 60 ℃持续30 s, 持续40个循环。以GAPDH为内参,通过2-△△Ct方法计算相对表达量。以下引物用于qRT-PCR:GGT5上游引物5′-GTCAGCCTAGTCCTGCTGG-3′,GGT5下游引物3′-GGATGGCTCGTCCAATATCCG-5′;GAPDH上游引物5′-ATCTTCCAGGAGCGAGATCC-3′,GAPDH下游引物3′-ACCACTGACACGTTGGCAGT -5′。

1.7 蛋白质印迹分析(Western blot)

在蛋白质裂解缓冲液(RIPA)中充分裂解细胞,并在超声条件下进一步破碎。离心后收集上清液,并通过BCA蛋白质定量测定法测定蛋白质水平。在10%十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶上分离蛋白质并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将膜与针对GGT5(PA5-30042, Thermo Fisher, 1∶5 000)和GAPDH(60004-1-Ig, Ptg, 1∶5 000)的一抗孵育18 h,随后与二抗孵育后,通过增强化学发光检测发光强度。

1.8 生存分析

Kaplan-Meier分析是由Oncomir创建的在线网站,用于分析与肿瘤相关的各种基因的存活率。本研究根据GGT5的中位表达将GGT5分为2组,并通过对数秩检验分析GGT5在肝癌中与患者预后的相关性,以确定2组的生存曲线是否存在统计学差异。本研究还使用单变量和多变量COX回归分析来验证GGT5与HCC预后的关系。SPSS 22.0用于确定显著性(P)值,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GGT5在肝癌中表达下调

本研究使用TIMER2.0数据库探索GGT5在正常组织和多种肿瘤组织中的表达水平,结果显示, GGT5在包括肝癌(LIHC)在内的大多数肿瘤中表达量较低,只有少数肿瘤GGT5表达低(图1A)。PubMed数据库搜索表明,GGT5基因尚未在HCC中单独报道。因此,本研究以GGT5为切入点,通过TCGA数据库下载了HCC表达数据,分析GGT5在HCC中的表达。结果显示, GGT5在非配对肝癌组织和癌旁组织中(图1B)、成对的肝癌组织和癌旁组织中(图1C)呈显著低表达,这些结果也验证了之前的泛癌分析。此外, HPA数据库进一步证实了HCC组织中的GGT5蛋白水平也低于正常肝组织(图1D)。上述结果表明,与邻近肝组织相比, GGT5在HCC组织中表达下调。

2.2 GGT5表达水平与肝癌患者临床病理特征的关系

本研究使用UALCAN检查了GGT5在HCC中的表达和临床特征,结果显示, GGT5与肝癌患者的年龄、性别、种族、组织学类型和肿瘤分期相关,GGT5mRNA表达增加可能是HCC的诊断生物标志物。见图2。

A: Timer2.0数据库显示GGT5在不同肿瘤中的表达水平; B: TCGA数据库中未配对的HCC组织中GGT5的表达水平; C: TCGA数据库中配对的HCC组织中GGT5的表达水平; D: 基于HPA数据库的正常肝组织和HCC组织中GGT5表达水平的比较。图1 肝细胞癌患者中GGT5表达水平

A: 不同年龄的GGT5表达水平; B: 不同性别的GGT5表达水平; C: 不同肿瘤分期的GGT5表达水平; D: 不同种族的GGT5表达水平; E: 不同组织学类型的GGT5表达水平; F: 不同淋巴结转移状态的GGT5表达水平。TPM: 样本中平均每一百万个转录本中对应于特定基因或转录本的数量; ∗P<0.05, ∗∗P<0.01, ∗∗∗P<0.001, nsP>0.05。图2 GGT5表达水平与肝癌患者临床病理特征的关系

2.3 GGT5在HCC中的预后潜力

为了进一步探究GGT5对HCC预后的影响,通过收集TCGA数据库中HCC患者的临床信息,本研究根据GGT5的表达水平将其分为高表达组和低表达组。Kaplan-Meier 生存曲线分析显示,GGT5表达更高的患者的总体生存期优于GGT5表达低的患者(P=0.007 7)(图3A), 无病生存期(P=0.007 8)、无进展生存期(P=0.002 1)和疾病特异性生存期(P=0.005 8)(图3A)也得到了类似的结果。值得注意的是, GGT5的低表达与HCC患者的预后不良相关, GGT5的表达越高表明预后越差(图3B、3C), GGT5可能是影响HCC进展的标志物。本研究采用受试者工作特征(ROC)曲线分析了GGT5对HCC患者存活影响的预测准确性和风险评分,结果显示GGT5是HCC患者1年、3年、5年预后的良好指标,其曲线下面积(AUC)值分别为0.539、0.583、0.527(图3D)。上述结果表明GGT5的表达与HCC患者的疾病进展有关。

2.4 使用GO和KEGG分析HCC中的GGT5共表达基因

为了研究GGT5在HCC中的生物学意义,本研究通过Linked Omics数据库分析了GGT5在LIHC队列中的共表达网络。图4A显示, 5 328个基因(红点)与GGT5显著正相关,而2 460个基因(绿点)与GGT5显著负相关[错误发现率(FDR)<0.01]。本研究确定了与GGT5表达正相关的前50个基因和与GGT5表达负相关的前50个基因,并使用热图对其进行可视化(图4B、4C)。与GGT5最密切正相关的基因包括AEBP1、PTGIR和PODN, 而与GGT5负相关的基因包括ESM1、CXorf57和PRIM1。对这些基因进一步行GO和KEGG富集分析。GO分析表明这些基因在以下GO项中富集: 生物过程,包括肝癌细胞的线粒体形态,细胞的蛋白质的折叠(图4D); 细胞成分,包括肝癌细胞代谢中色素复合物相关(图4E); 分子功能,包括结合RNA前体、催化活性(图4F)。KEGG分析表明,这些共表达基因主要参与肝癌细胞的蛋白酶体重组(图4G)。上述结果表明,GGT5的共表达与HCC发展的过程密切相关。

2.5 GGT5的表达与HCC患者中免疫细胞的浸润的相关性

为了进一步了解GGT5与HCC患者的免疫细胞浸润的关系,本研究进行了免疫细胞浸润评估,结果显示, GGT5的低表达与HCC中肿瘤的纯度呈负相关(r=-0.52,P<0.001), 而与B细胞(r=0.103,P<0.05)、CD8+T细胞(r=0.193,P<0.001)、CD4+T细胞(r=0.252,P<0.001)、巨噬细胞(r=0.304,P<0.001)、中性粒细胞(r=0.213,P<0.001)、树突状细胞(r=0.212,P<0.001)浸润相关。见图5。

A: Kaplan-Meier生存曲线分析GGT5的表达与HCC患者生存预后的关系; B、C: GGT5在TCGA数据库中的生存曲线; D: GGT5的表达在不同时期的ROC曲线。图3 GGT5的低表达水平与肝癌患者预后不良有关

2.6 GGT5在HCC细胞中的表达

为了进一步验证HCC中的GGT5的表达水平,本研究通过PCR检测和Western blot检测了GGT5在HCC细胞株中的表达差异,结果显示GGT5在HCC细胞株中的表达下调,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.001)。见图6。

3 讨 论

随着精准医学和免疫治疗的最新进展,HCC的治疗取得了重大突破,但由于HCC的高度异质性,其在治疗领域仍面临许多挑战[11-14]。除了分子病理学研究外,通过各种生物信息学工具发现HCC中具有诊断意义的分子标志物也非常有价值[15-16]。

近年来, GGT家族基因在各种肿瘤中的表达研究已成为研究的热点[17]。研究[18]表明GGT家族基因在各种肿瘤中表达异常,包括非小细胞肺癌、肝癌、肾细胞癌、胃癌、乳腺癌和其他恶性肿瘤。然而, GGT5尚未在HCC中报告。本研究首先回顾了数据库,发现GGT5在HCC组织中上调,并且HCC中的高GGT5表达通常预示着预后不良。ROC曲线分析表明GGT5可能具有作为HCC生物标志物的预测价值。本研究发现GGT5过表达与肝癌患者的年龄、性别、种族、组织学分级、病理分期和远处转移密切相关。本研究首次通过查询多个生物信息学数据库并将其与实验相结合来探索GGT5在HCC中的表达。本研究中,生存分析表明HCC中GGT5的低表达与较差的生存预后相关。

A: 在HCC中与GGT5共表达的基因; B: 与肝细胞癌GGT5正相关的前50个基因; C: 与肝细胞癌中表达负相关的前50个基因; D: 分析肝细胞癌中GGT5相关基因的GO生物过程; E: 分析HCC中GGT5相关基因的GO细胞成分; F: 分析肝细胞癌中GGT5相关基因GO分子功能; G: 肝细胞癌中GGT5相关基因的KEGG通路分析。图4 GGT5在HCC中共表达基因以及GO和KEGG分析

A: PCR检测GGT5在HCC细胞中的表达; B: Western blot检测GGT5在HCC细胞中的表达。与LO2比较, ∗∗P<0.01, ∗∗∗P<0.001。图6 GGT5在HCC细胞中的表达

为了阐明GGT5在HCC中的生物学作用,本研究查询了Linked Omics数据库,发现GGT5不仅对HCC患者的预后有显著影响,而且大多数与GGT5在HCC中共表达的基因也与HCC患者的预后显着相关。这些共表达基因参与肝癌细胞的蛋白酶体重组。HCC细胞参与复杂的肿瘤微环境,包括细胞外基质、基质细胞和免疫细胞,共同构成了HCC细胞生长和转移的免疫微环境[19-21]。为了进一步研究GGT5与肿瘤免疫微环境的关系和潜在机制,本研究进行了与免疫相关基因的相关性分析。GGT5与HCC中许多免疫相关细胞的表达呈正相关,包括B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞浸润相关。

本研究存在的局限性有: ① 由于分析不同的数据库来源,测序数据缺乏特异性,可能引入了样本偏差; ② 缺乏体外和体内实验来验证GGT5对HCC的潜在功能作用,未来需要研究GGT5对HCC的机制作用; ③ 本研究表明GGT5表达与免疫细胞浸润密切相关,但缺乏直接证据表明GGT5通过参与免疫细胞浸润影响HCC患者。因此, GGT5通过免疫调节参与HCC发展的机制仍有待进一步研究。

综上所述, GGT5在HCC组织中高表达, GGT5的低表达通常预示着预后不良。本研究结果表明, GGT5的表达与T细胞、B细胞和NK细胞呈正相关。本研究为GGT5和免疫细胞在肝细胞肿瘤微环境中浸润的相关机制提供了新的见解。