circ_0000885通过靶向miR-944调控胃癌细胞的增殖和凋亡

次仁央宗, 王朝华

(西藏自治区第二人民医院 消化科, 西藏 拉萨, 850000)

胃癌发病率高,其早期临床症状不明显,确诊时多为晚期[1]。目前,胃癌的治疗主要包括手术、化疗、放疗和靶向治疗等手段,但由于晚期、耐药和复发率高,患者5年生存率较低[2]。胃癌已严重影响患者的生活质量和生命健康。环状RNA(circRNA)是一类具有共价闭环的非编码RNA,由于其环状结构, circRNA非常稳定,此外circRNA序列高度保守,并以组织或细胞特异性的方式表达[3-4]。研究[5]表明, circ_0000885在骨肉瘤中表达上调,可作为骨肉瘤预后不良的生物标志物。下调circ_0000885可抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和诱导细胞周期阻滞[6]。沉默circ_0000885可抑制肝癌细胞的生长能力[7]。然而, circ_0000885在胃癌中作用的相关研究较少。此外,通过Circinteractome预测软件发现,微小RNA(miR)-944在circ_0000885上有结合位点。研究[8]表明, miR-944在胃癌细胞中表达下降,过表达miR-944可抑制胃癌细胞的上皮间质转化,抑制其表达可促进胃癌细胞转化。尽管已有研究确定miR-944在胃癌中的作用,但circ_0000885在胃癌中的作用以及miR-944是否参与其调控作用还尚未阐明。因此,本研究探讨circ_0000885在胃癌AGS细胞增殖和凋亡中的作用以及circ_0000885与miR-944之间是否存在靶向关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

本研究共招募30例在本院收治的胃癌患者(2017年1月—2019年1月),患者术前均未接受放疗和化疗,手术获得胃癌组织及相应癌旁组织后, -80 ℃保存,每例患者均签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 材料

人正常胃黏膜细胞GES-1和胃癌细胞系AGS、HGC-27、N87、SNU-484购自中国科学院上海细胞库; 胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养液购自美国Hyclone公司; 由日本Takara公司提供Trizol试剂、反转录、qRT-PCR试剂盒; 上海晶抗生物工程有限公司提供MTT和Annexin V-FITC/PI试剂盒; RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸(BCA)试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司; 美国Invitrogen公司提供Lipofectamine2000试剂。

1.3 细胞转染与分组

取对数生长期AGS细胞,根据Lipofectamine2000转染试剂说明书,将si-NC、si-circ_0000885、pcDNA、pcDNA-circ_0000885、miR-NC、miR-944、si-circ_0000885与anti-miR-NC、si-circ_0000885与anti-miR-944转染至AGS细胞,分别记为si-NC组、si-circ_0000885组、pcDNA组、pcDNA-circ_0000885组、miR-NC组、miR-944, si-circ_0000885+anti-miR-NC组或si-circ_0000885+anti-miR-944组,未处理的细胞设为NC组。

1.4 逆转录-实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测circ_0000885和miR-944的表达

提取细胞总RNA,反转录成cDNA,将合成的cDNA用作PCR扩增的模板,分别以GAPDH和U6为内参,检测circ_0000885和miR-944的表达水平,相对表达量采用2-△△Ct法计算。circ_0000885上游引物: 5′-ACTGCCAGAAAGTGTGTCCC-3′; 下游引物: 5′-CGGGCCTCGTTTTGAACATC-3′。miR-944上游引物: 5′-GCCGAGAAATTATTGTACAT-3′; 下游引物: 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。GAPDH上游引物: 5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′; 下游引物: 5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3′。U6上游引物: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′; 下游引物: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.5 MTT

取各组AGS细胞悬液(2.5×104个/mL), 96孔板每孔加入100 μL, 随后向每个孔中加入20 μL MTT (5 mg/mL), 37 ℃孵育4 h, 弃细胞上清液,用DMSO溶解MTT晶体,并在450 nm处测量吸光度。

1.6 流式细胞术

收集各组细胞,重悬于1×结合缓冲液,并用Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI)各5 μL, 在20 ℃下染色15 min, 通过FACScan流式细胞仪对样品凋亡进行分析。

1.7 蛋白质免疫印迹(Western blot)

用1×细胞裂解缓冲液提取细胞蛋白。将每个样品的蛋白质(50 μg)进行电泳,并转移到硝化纤维膜上。随后5%脱脂牛奶封闭,一抗4 ℃孵育过夜。然后,山羊抗兔HRP标记的二抗室温孵育2 h。ECL底物试剂盒用于进行信号的化学发光检测, Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 circ_0000885和miR-944在胃癌组织中的表达

相较于癌旁组织,胃癌组织中circ_0000885高表达, miR-944低表达,差异有统计学意义(P<0.05), 见表1。与GES-1细胞比较,胃癌细胞系AGS、HGC-27、N87、SNU-484中, circ_0000885表达升高, miR-944表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。circ_0000885在AGS细胞中的表达水平高于HGC-27、N87、SNU-48细胞,差异有统计学意义(P<0.05), 故后续实验选择AGS细胞,见表2。

表1 circ_0000885和miR-944在胃癌组织中的表达

表2 circ_0000885和miR-944在胃癌细胞系中的表达

2.2 敲减circ_0000885对AGS细胞增殖和凋亡的影响

与si-NC组比较, si-circ_0000885组的circ_0000885表达降低, AGS细胞OD值以及PCNA、Bcl-2蛋白水平降低,凋亡率和Bax蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05); NC组和si-NC组各指标比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1和表3。

A: 细胞凋亡流式图; B: 增殖和凋亡相关蛋白表达。图1 敲减circ_0000885对AGS细胞增殖和凋亡的影响

表3 circ_0000885敲低对AGS细胞增殖和凋亡的影响

2.3 circ_0000885靶向调控miR-944的表达

通过Circinteractome的预测, miR-944被发现在circ_0000885上有结合位点(图2)。转染miR-944, WT-circ_0000885组的荧光素酶活性减低,差异有统计学意义(P<0.05), 但不影响MUT-circ_0000885组(P<0.05), 见表4。circ_0000885上调或下调可分别抑制和促进细胞中miR-944的表达,差异有统计学意义(P<0.05), 见表5。

图2 circ_0000885的序列中含有与miR-944互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

表5 circ_0000885调控miR-944表达

2.4 过表达miR-944对AGS细胞增殖和凋亡的影响

与miR-NC组比较, miR-944组的miR-944表达升高, AGS细胞OD值以及PCNA、Bcl-2蛋白水平降低,凋亡率和Bax蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05); NC组和miR-NC组各指标比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表6。

表6 过表达miR-944对AGS细胞增殖和凋亡的影响

2.5 miR-944敲低逆转了敲减circ_0000885对AGS细胞增殖和凋亡的影响

相较于si-circ_0000885+anti-miR-NC组, si-circ_0000885+anti-miR-944组的miR-944表达降低, AGS细胞OD值以及PCNA、Bcl-2蛋白水平升高,凋亡率和Bax蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05); si-circ_0000885组和si-circ_0000885+anti-miR-NC组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图4、表7。

A: 细胞凋亡流式图; B: 增殖和凋亡相关蛋白表达。图3 过表达miR-944对AGS细胞增殖和凋亡的影响

A: 细胞凋亡流式图; B: 增殖和凋亡相关蛋白表达。图4 下调miR-944逆转了敲减circ_0000885对AGS细胞增殖和凋亡的影响

表7 下调miR-944逆转了敲减circ_0000885对AGS细胞增殖和凋亡的影响

3 讨 论

circRNA异常表达与胃癌的恶性表型密切相关。如circPTK2在胃癌组织和细胞中表达显著下调,上调circPTK2可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,而抑制circPTK2表达则效果相反[9]。circ_0000751低表达与胃癌患者的肿瘤淋巴结转移分期、肿瘤体积和淋巴结转移呈反比,过表达circ_0000751可抑制胃癌肿瘤的进展、迁移、侵袭和转移[10]。circPTK2表达下调与胃癌患者的低生存率相关,过表达circPTK2在体内外可抑制胃癌细胞的增殖、集落形成、DNA合成、侵袭、异种移植瘤生长和肺转移,而下调circPTK2则结果相反[11]。过表达或上调circDIDO1可抑制或促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭[12]。circ_0006470在胃癌细胞中表达升高,沉默circ_0006470可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[13]。下调circ-HN1可通过miR-485-5p/GSK3A通路抑制胃癌进展[14]。敲除circ_0091994可通过诱导凋亡降低胃癌细胞的活力[15]。circ-RNF111敲低可诱导胃癌细胞凋亡,减弱细胞糖酵解、增殖以及移动能力[16]。本研究中,胃癌组织和细胞系AGS、HGC-27、N87、SNU-484中高表达circ_0000885, 敲减circ_0000885降低了AGS细胞OD值以及PCNA、Bcl-2 表达水平,升高了细胞凋亡率和Bax表达水平,提示敲减circ_0000885可抑制AGS细胞增殖,并促进凋亡。

研究[6]表明, circ_0000885可作为内源竞争性RNA调控微小RNA(miRNA)表达来影响骨肉瘤细胞的恶性行为。通过Circinteractome预测网站,本研究发现, miR-944在circ_0000885上存在结合位点,随后,本研究证实miR-944是circ_0000885的靶基因,且circ_0000885负向调控胃癌细胞中miR-944的表达。研究[17]显示, miR-944在人类多种癌症中发挥抑癌作用。肺腺癌组织和细胞低表达miR-944, 上调miR-944可抑制癌症细胞的生长。上调miR-944可降低结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而敲除miR-944表达则结果相反[18]。miR-944在三阴性乳腺癌细胞中低表达,其过表达可抑制癌细胞的侵袭、迁移、和上皮间质转化[19]。与既往研究一致,本研究也证实miR-944在为胃癌中发挥抗癌作用。胃癌组织和细胞系AGS、HGC-27、N87、SNU-484中低表达miR-944, 过表达miR-944降低了AGS细胞OD值以及PCNA、Bcl-2 表达水平,升高了细胞凋亡率和Bax表达水平。进一步回复实验显示,下调miR-944逆转了敲减circ_0000885对AGS细胞增殖和凋亡的影响,OD值以及PCNA、Bcl-2 表达水平升高,凋亡率和Bax表达水平降低。

综上所述,胃癌组织和细胞中高表达circ_0000885, 低表达miR-944。miR-944是circ_0000885的功能靶标,敲低circ_0000885可通过靶向上调miR-944抑制胃癌细胞的生长,提示circ_0000885可能是胃癌的潜在治疗靶点。但本研究仅限于体外实验,其在体内的作用还有待进一步研究。