松油烯-4-醇通过线粒体途径诱导宫颈癌Siha 细胞凋亡的机制研究

袁乡石，苏羽屾，荣冬芸，曹 煜，王 叶，唐姗姗

（贵州医科大学，贵州 贵阳 550004）

宫颈癌是人类最常见的乳头状瘤病毒（HPV） 相关癌症，疫苗接种在很大程度上仍然无法普及，一旦确诊，预后较差，特别是转移或复发性病例［1］。免疫治疗和靶向治疗已经能够延长整体生存期［2］，然而存在与化疗相关的缺点，包括频繁复发、耐药性、对剩余的非癌细胞的副作用［3］。因此，寻找适合的药物治疗宫颈癌已成为科研界密切关注的问题。珊瑚姜为苗医常用药材，具有抗细菌、抗真菌及抗肿瘤等活性［4-5］，松油烯-4-醇是其主要成分之一［6-7］，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌等活性［8-9］。松油烯-4-醇被证明对人黑色素瘤细胞［10］、人非小细胞肺癌［11］、人白血病细胞［8］、人胃肠肿瘤细胞［12］具有抑制作用。但对于人宫颈癌Siha 细胞的影响及其作用机制方面的研究却少有报道。课题组前期研究发现，松油烯-4-醇具有较强的抗宫颈癌活性，表明它也是一种很好的抗宫颈癌候选药物。因此，本研究将进一步探索松油烯-4-醇对人宫颈癌Siha 细胞的影响及其作用机制。

1 材料

1.1 细胞 人宫颈癌Siha 细胞系购自广州吉妮欧生物科技有限公司，用含10% FBS 的DMEM 培养基于5% CO2、37 ℃恒温箱中培养，待细胞长至85%左右时进行传代及后续细胞实验。

1.2 试剂 松油烯-4-醇（纯度≥95%，货号1125A021，北京索莱宝科技有限公司）。一步法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（货号C1086，上海碧云天生物技术有限公司）；Annexin V-FITC/PI 试剂盒、JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒（货号MA0220-1、MA0338，大连美仑生物技术有限公司）；RT-qPCR 逆转录试剂盒 ［货号RR036A，生工生物工程（上海） 股份有限公司］； 山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（货号ZB2301、ZB2305，北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 仪器 共聚焦显微镜（日本Olympus 公司）； RTqPCR 仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）； 电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 共聚焦显微镜观察细胞形态变化 将Siha 细胞以每孔1×105个的密度接种至6 孔板，贴壁后分别用0 （即0.1% DMSO 处理的对照组）、5、7.5、10 μmol/L 松油烯-4-醇、10 μmol/L 顺铂（阳性对照组） 处理24 h，通过共聚焦显微镜（×200） 明场视野观察细胞形态变化。

2.2 MTT 法检测细胞相对增殖率 将Siha 细胞以每孔5 000个的密度接种至96 孔板，贴壁后分别用0、5、7.5、10 μmol/L 松油烯-4-醇及10 μmol/L 顺铂处理细胞，24 h后加入10 μL MTT 溶液，继续培养4 h 后吸弃培养基，加入150 μL DMSO，采用酶标仪检测各孔在490 nm 波长处的吸光度（A），计算细胞增殖率。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 按“2.1” 项下方法处理细胞，用不含EDTA 的胰酶消化，离心并用流式缓冲液吹散细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI 避光室温孵育15 min，流式细胞仪上机检测并记录。细胞凋亡率＝早期细胞凋亡率＋晚期细胞凋亡率。

2.4 TUNEL 法检测细胞凋亡水平 按“2.1” 项下方法处理细胞，PBS 洗涤1 次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗涤后用含0.3%TritonX-100 的PBS 室温孵育5 min，PBS 洗涤后加50 μL TUNEL 检测液，37 ℃避光孵育60 min。通过共聚焦显微镜观察各组Siha 细胞染色情况，以细胞核呈绿色荧光为TUNEL 阳性细胞，统计高倍镜（×400） 下阳性细胞数目，评估Siha 细胞凋亡水平。

2.5 线粒体膜电位检测 按“2.1” 项下方法处理细胞，PBS 洗涤1 次，加入1 mL 细胞培养液，再加入1 mL JC-1染色工作液，充分混匀，37 ℃孵育20 min，吸弃上清，用JC-1 染色缓冲液洗涤2 次，再加入2 mL 细胞培养液，通过共聚焦显微镜（×200） 观察。当线粒体膜电位（Δψm） 大于120 mV 时，JC-1 在线粒体基质中形成聚合物，被490 nm 波长激发光激发后发出红光； 当线粒体膜电位（Δψm）小于120 mV 时，JC-1 不能聚集在线粒体基质中，单体JC-1 被490 nm 波长激发光激发后发出绿光，采用Image J 软件统计红色和绿色荧光强度，以红色和绿色荧光的比值表示线粒体膜电位的变化。

2.6 Western blot 法检测细胞 Bax、Bcl-2、cleavedcaspase9、cytochrome c 蛋白表达 Siha 细胞以每皿3.0×106个的密度接种至培养皿中，贴壁后分别用0、5、7.5、10 μmol/L 松油烯-4-醇及10 μmol/L 顺铂处理细胞24 h，收集各组细胞并提取总蛋白，经电泳、转膜、封闭后孵育一抗、二抗，化学发光试剂（ECL） 显影，采用Image J 软件进行灰度分析。

2.7 RT-qPCR 法检测细胞Bax、caspase9、cytochromec、HPVE6/E7 mRNA 表达 TRIzol 试剂提取Siha 细胞中RNA，使用cDNA 合成试剂盒将RNA 反转录成cDNA，并进行RT-qPCR 分析，反应条件为94 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

2.8 统计学分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，2 组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 松油烯-4-醇对Siha 细胞形态变化的影响 各浓度松油烯-4-醇、10 μmol/L 顺铂处理Siha 细胞后，细胞变小变圆，细胞质浓缩、形态不规则，细胞膜皱缩，细胞间距离增加，出现很多漂浮细胞，培养基中出现细胞碎片，见图1。

图1 各组细胞形态变化（×200）

3.2 松油烯-4-醇对Siha 细胞增殖率的影响 与对照组比较，各浓度松油烯-4-醇组、10 μmol/L 顺铂组细胞增殖率降低（P＜0.05），并且松油烯-4-醇作用呈剂量依赖性； 与10 μmol/L 顺铂组比较，10 μmol/L 松油烯-4-醇组细胞增殖率降低（P＜0.05），见图2。

图2 各组细胞相对增殖率变化（±s，n＝6）

3.3 松油烯-4-醇对Siha 细胞凋亡的影响

3.3.1 流式细胞术 与对照组比较，各浓度松油烯-4-醇组、10 μmol/L 顺铂组细胞凋亡率升高（P＜0.05），并且松油烯-4-醇作用呈剂量依赖性； 与10 μmol/L 顺铂组比较，10 μmol/L松油烯-4-醇组细胞凋亡率升高（P＜0.05），见图3。

图3 各组细胞凋亡率变化（±s，n＝3）

3.3.2 TUNEL 染色 与对照组比较，各浓度松油烯-4-醇组、10 μmol/L 顺铂组凋亡细胞数增加（P＜0.05），并且松油烯-4-醇作用呈剂量依赖性； 与10 μmol/L 顺铂组比较，10 μmol/L松油烯-4-醇组凋亡细胞数增加（P＜0.05），见图4。

图4 各组凋亡细胞数变化（±s，n＝3）

3.4 松油烯-4-醇对Siha 细胞线粒体膜电位的影响 线粒体膜电位偏高的对照组细胞发出强烈的红色荧光，随着松油烯-4-醇浓度增加，红色荧光逐渐减弱，而绿色荧光逐渐增加，10 μmol/L 顺铂组细胞膜上仍可见大量红色荧光。与对照组比较，各浓度松油烯-4-醇组、10 μmol/L 顺铂组线粒体膜电位降低（P＜0.05），并且松油烯-4-醇作用呈剂量依赖性； 与10 μmol/L 顺铂组比较，10 μmol/L 松油烯-4-醇组线粒体膜电位降低（P＜0.05），见图5。

图5 各组细胞线粒体膜电位变化（±s，n＝3）

3.5 松油烯-4-醇对Siha 细胞Bax、caspase9、cytochromec、HPVE6、HPVE7 mRNA 表达的影响 与对照组比较，各浓度松油烯-4-醇组、10 μmol/L 顺铂组HPVE6/E7 mRNA 表达降低（P＜0.05），Bax、caspase9、cytochromecmRNA 表达升高（P＜0.05），并且松油烯-4-醇作用呈剂量依赖性；与10 μmol/L 顺铂组比较，10 μmol/L 松油烯-4-醇组细胞HPVE6/E7 mRNA 表达降低 （P＜0.05），Bax、caspase9、cytochromecmRNA 表达升高（P＜0.05），见图6。

图6 各组细胞Bax、caspase9、cytochrome c、HPV E6、HPV E7 mRNA 表达变化（±s，n＝3）

3.6 松油烯-4-醇对 Siha 细胞 Bax、Bcl-2、cleavedcaspase9、cytochrome c 蛋白表达的影响 与对照组比较，各浓度松油烯-4-醇组、10 μmol/L 顺铂组细胞Bax、cleavedcaspase9、cytochrome c 蛋白表达升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达降低（P＜0.05），并且松油烯-4-醇作用呈剂量依赖性； 与10 μmol/L 顺铂组比较，10 μmol/L 松油烯-4-醇组细胞Bax、cleaved-caspase9、cytochrome c 蛋白表达升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达降低（P＜0.05），见图7。

图7 各组细胞Bax、Bcl2、caspase9、cleaved-caspase9、cytochrome c 蛋白表达变化（±s，n＝3）

4 讨论

松油烯-4-醇是一种从芳香植物中提取的精油［13］，主要通过诱导细胞凋亡发挥抗癌活性［8，10-12］。本研究发现，松油烯-4-醇对Siha 细胞有较强的抑制作用，包括抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、降低细胞内癌基因表达等。越来越多的证据表明，Bax 是宫颈癌细胞凋亡的关键介质，激活Bax可能是宫颈癌治疗的新策略［14］。Bax 是Bcl-2 家族的一个关键促凋亡蛋白，是线粒体途径的主要调节因子［15］，其可促进细胞凋亡［16-17］。线粒体是活细胞中产生能量的重要细胞器，其功能障碍与细胞凋亡、坏死和自噬有关［18］。本研究发现，不同浓度松油烯-4-醇作用于Siha 细胞后，细胞变小、变圆，细胞质浓缩，细胞膜皱缩，细胞间距离增加，出现很多漂浮细胞，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率及凋亡细胞数增多，Bax 蛋白和mRNA 表达均升高，Bcl-2 蛋白表达降低，并呈现出明显的剂量依赖性，提示松油烯-4-醇可能通过调节Bcl-2 家族相关蛋白的表达诱导Siha 细胞凋亡。本研究发现，线粒体膜电位（Δψm） 随着松油烯-4-醇浓度增加而逐渐降低，造成线粒体功能障碍，提示线粒体参与了细胞凋亡的调控。线粒体膜电位的丧失总是伴随着cytochrome c 的释放［19］。cytochrome c 在dATP 或ATP 存在的情况下直接激活Apaf-1，并诱导形成名为“凋亡小体”的多聚体复合物，该复合物介导了启动子caspase-9 的激活［20-21］。本研究结果显示，caspase9 蛋白表达没有明显变化，但cleaved-caspase9、cytochrome c 蛋白和mRNA 表达均升高，提示松油烯-4-醇可能启动线粒体依赖的内源性凋亡途径，导致线粒体功能障碍，线粒体膜电位降低，释放大量cytochrome c，同时激活caspase-9，诱导细胞凋亡。

大约5%的宫颈癌与人乳头瘤病毒感染有关，几乎所有宫颈癌病例都可归因于高危HPV 感染［22］。大多数HPV 感染是无害和自发清除的，但持续的高危HPV 感染（特别是16 型和18 型） 可导致宫颈癌发生［23-25］。高危乳头状瘤病毒有2 种癌基因，即病毒E6 和E7 基因，HPVE6/E7 癌基因的表达对HPV 的转化活性至关重要，可以影响细胞mRNA 的合成，因此深入了解HPVE6/E7 癌基因的表达具有重要作用［26］。本研究表明，松油烯-4-醇可降低细胞内HPVE6/E7 mRNA 表达，可能通过抑制细胞内相关癌基因的表达从而起到抑制宫颈癌的作用。

综上所述，松油烯-4-醇具有较强的抗肿瘤细胞作用，可抑制Siha 细胞增殖，并通过线粒体途径诱导细胞凋亡，升高凋亡相关蛋白Bax、cytochrome c、cleaved-caspase9 的表达，降低Bcl-2 的表达，同时降低HPVE6/E7 癌基因的表达。本研究为临床开发中药治疗宫颈癌提供了实验依据，有望为临床治疗宫颈癌提供有效药物。