银蓝调脂胶囊对ZDF 大鼠（fa/fa） 高脂血症合并糖尿病的改善作用

甘海宁，郑柳怡，黄雪君，彭 莎，黎乐怡，陈玉兴*

［1.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院），广东 广州 510095； 2.广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095； 3.广州中医药大学，广东 广州 510275］

随着我国人口老龄化与生活方式的变化，国内人群的血脂水平逐渐上升，血脂异常的患病率亦显著增大。我国35 岁以上总人群血脂异常的患病率约为34.7%［1］，而血脂异常将导致心血管疾病事件（冠心病和中风） 的增加［2］。此外，糖尿病的流行亦带来了严重的公共健康问题，2017年糖尿病占全球死因的10.7%，在中国就有超过84 万患者死于糖尿病［3］。血脂、血糖的异常升高是糖脂代谢紊乱性疾病的主要特征。临床观察显示，高血脂症和糖尿病关系密切，高脂血症合并有糖尿病的患者占高脂血症总患者的21.20%［4］。因此，开发一种可有效地调节糖、脂代谢，并有可能降低糖脂代谢紊乱所引起的心脑血管疾病及并发症的中药制剂显得尤为重要。

银蓝调脂胶囊由绞股蓝、蜂胶、银杏叶、化橘红4 味中药组成，为广东省第二中医院自主研发的中药新制剂，具有益气健脾、活血化瘀、祛痰利湿等功效，用于气滞瘀血型高脂血症的治疗。前期实验发现银蓝调脂胶囊具有较好的降脂作用［5］，在此基础上，本实验通过高脂饮食诱导ZDF 大鼠（fa/fa） 建立高脂血症合并糖尿病模型，观察银蓝调脂胶囊对该模型大鼠血脂、血糖、炎症相关指标、肝脏脂质合成代谢关键酶乙酰辅酶A 羧化酶1 （ACC1）、脂肪酸合成酶（FAS） 及转录因子肝X 受体α （LXRα） 蛋白表达的影响，为探讨银蓝调脂胶囊调脂、降糖的作用及机制提供重要的实验依据。

1 材料

1.1 动物 24 只ZDF 模型大鼠（fa/fa），6 只ZDF 对照大鼠（fa/＋），雄性，SPF 级，体质量180 ～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK （京） 2016-0006。

1.2 药物 银蓝调脂胶囊（批号J1911005） 由广东省第二中医院中药制剂研究室提供。盐酸二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司，批号AAW6062，0.5 g/片）； 非诺贝特胶囊（美国雅培公司，批号27232，规格200 mg/粒）。

1.3 试剂 葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c） 检测试剂盒 （批号20190831、20191018、20191018、20190714、20190714，南京建成生物工程研究所）； 大鼠肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、白介素-6 （IL-6）、糖化血红蛋白（HbA1c）、脂联素（ADPN）、瘦素（Leptin）、胰岛素（INS） 酶联免疫检测试剂盒（批号569180611、385180619、603190419、118180619、396180619、358180619，天津安诺瑞康生物技术有限公司）； 乙酰辅酶A 羧化酶（ACC1）、脂肪酸合成酶（FAS）、转录因子肝X 受体α（LXRα）、β 肌动蛋白 （β-actin） 抗体 （货号AF6421、BF0557、DF6864、AF7018，美国Affinity 公司）。

1.4 仪器 JJ500 型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；BSA2245 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； 5450 型小型高速离心机 （德国Eppendorf 公司）；PowerPac 基础电泳仪（美国Bio-Rad 公司）； 7020 型全自动生化分析仪（日本日立公司）； Varsoskan Flash 多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）； TP1020 型全密封自动脱水机、RM2235 型轮式切片机、ST5020 型自动染色机（德国徕卡公司）； YD62 型石蜡包埋机、YD-6L 型智能冰冻包埋机（金华市益迪医疗设备有限公司）； DP2-BSW 型病理图像采集系统（日本奥林巴斯公司）。

2 方法

2.1 分组、造模与给药 ZDF 模型大鼠 （fa/fa） 饲喂Purina＃5008 诱导饲料（含粗蛋白23.5%、粗脂肪6.5%），ZDF 对照大鼠 （fa/＋） 饲喂正常大鼠维持饲料，每只50 g［6］。饲喂1 个月后，将ZDF 大鼠（fa/fa） 随机分成模型组、非诺贝特＋二甲双胍组（二甲双胍0.180 g/kg＋非诺贝特0.018 g/kg） 和银蓝调脂胶囊高、低剂量组（5.148、2.574 g/kg），每组6 只； ZDF 大鼠（fa/＋） 作为正常组。各给药组灌胃相应剂量药物，正常组和模型组灌胃给予蒸馏水（10 mL/kg），每天1 次，连续12 周。其间除正常组外，其余各组持续饲喂诱导饲料。

2.2 血清糖脂代谢和炎症相关指标检测 末次给药1 h后，各组大鼠禁食不禁水，麻醉后腹主动脉取血，全血3 000 r/min 离心10 min，收集血清，按相应试剂盒说明书检测血清TC、TG、HDL-c、LDL-c、GLU、INS、HbA1c、ADP、TNF-α、Leptin 水平。

2.3 HE 染色观察肝组织病理形态 大鼠处死后取肝脏，一部分于-80 ℃保存，用于蛋白免疫印迹实验； 另一部分固定于多聚甲醛中，用于HE 染色。取固定于多聚甲醛的肝组织，行脱水、包埋、切片、脱蜡等操作后，常规HE染色，脱水后封片，于显微镜下观察，并采用Image J 软件定量分析脂滴空泡的相对面积比例。

2.4 蛋白免疫印迹法检测肝组织ACC1、FAS、LXRα 蛋白表达 取大鼠肝组织约100 mg，加入1 mL RIPA 蛋白裂解液进行研磨，4 ℃放置10 min 后12 000 r/min 离心5 min，采用BCA 蛋白试剂盒测定上清液的蛋白浓度，加5×上样缓冲液后进行蛋白变性。蛋白上样后经电泳、转膜、封闭，孵育一抗、二抗，添加ECL 化学发光液后于成像系统中显影成像，采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参计算ACC1、FAS、LXRα 蛋白相对表达量。

2.5 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件进行处理，计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时用SNK 法，方差不齐时用Dunnett’s T3法。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 银蓝调脂胶囊对ZDF 大鼠（fa/fa） 血脂水平的影响 如表1 所示，与正常组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-c 水平升高（P＜0.01），HDL-c 水平降低（P＜0.01）； 与模型组比较，非诺贝特＋二甲双胍组和银蓝调脂胶囊各剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-c 水平降低 （P＜0.05，P＜0.01），银蓝调脂胶囊高剂量组大鼠血清HDL-c水平升高（P＜0.05）。

表1 各组大鼠血清TC、TG、HDL-c、LDL-c 水平比较（mmol/L，±s，n＝6）

表1 各组大鼠血清TC、TG、HDL-c、LDL-c 水平比较（mmol/L，±s，n＝6）

注： 与正常组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别TCTGHDL-cLDL-c正常组4.078±0.3681.590±0.2301.588±0.1970.807±0.112模型组10.184±1.493**4.821±0.478**0.676±0.322**1.982±0.359**非诺贝特＋二甲双胍组5.454±1.489＃＃2.911±0.385＃＃0.763±0.3930.984±0.103＃＃银蓝调脂胶囊高剂量组6.758±0.813＃＃3.483±0.707＃＃1.247±0.394＃1.132±0.146＃＃银蓝调脂胶囊低剂量组7.013±0.850＃＃3.862±0.461＃＃1.031±0.4091.314±0.088＃

3.2 银蓝调脂胶囊对ZDF 大鼠（fa/fa） 血清Leptin、ADPN水平的影响 如表2 所示，与正常组比较，模型组大鼠Leptin 水平升高（P＜0.01），ADPN 水平降低（P＜0.01）； 与模型组比较，非诺贝特＋二甲双胍组和银蓝调脂胶囊各剂量组Leptin 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），ADPN 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 各组大鼠血清Leptin、ADPN 水平比较（±s，n＝6）

表2 各组大鼠血清Leptin、ADPN 水平比较（±s，n＝6）

注： 与正常组比较，** P ＜0.01； 与模型组比较，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别Leptin/（pg·mL-1）ADPN/（ng·mL-1）正常组298.633±81.56418.845±1.337模型组597.745±102.819**8.684±1.332**非诺贝特＋二甲双胍组376.387±59.401＃＃15.031±1.675＃＃银蓝调脂胶囊高剂量组389.915±104.981＃＃12.738±3.099＃＃银蓝调脂胶囊低剂量组475.113±108.958＃11.297±2.471＃

3.3 银蓝调脂胶囊对ZDF 大鼠（fa/fa） 血糖的影响 如表3 所示，与正常组比较，模型组大鼠血清GLU、HbA1c水平升高（P＜0.01），INS 水平降低（P＜0.01）； 与模型组比较，非诺贝特＋二甲双胍组和银蓝调脂胶囊各剂量组大鼠血清GLU、HbA1c 水平降低 （P＜0.01），INS 水平升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠血清GLU、GHB、INS 水平比较（±s，n＝6）

表3 各组大鼠血清GLU、GHB、INS 水平比较（±s，n＝6）

注： 与正常组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别GLU/（mmol·L-1）HbA1c/（mmol·L-1）INS/（pg·mL-1）正常组5.970±0.4721.854±0.925588.144±14.234模型组35.372±2.742**5.253±0.465**344.743±26.685**非诺贝特＋二甲双胍组21.449±1.700＃＃2.561±0.395＃＃480.453±73.970＃银蓝调脂胶囊高剂量组22.545±2.259＃＃2.814±0.479＃＃437.778±41.780＃银蓝调脂胶囊低剂量组26.783±2.204＃＃3.147±0.316＃＃404.373±29.458＃

3.4 银蓝调脂胶囊对ZDF 大鼠（fa/fa） 血清TNF-α、IL-6水平的影响 如表4 所示，与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，非诺贝特＋二甲双胍组、银蓝调脂胶囊各剂量组大鼠血清TNFα、IL-6 水平降低（P＜0.01）。

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-6 水平比较（±s，n＝6）

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-6 水平比较（±s，n＝6）

注： 与正常组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别TNF-α/（pg·mL-1）IL-6/（ng·mL-1）正常组67.904±4.08311.369±1.491模型组115.539±4.993**24.303±3.808**非诺贝特＋二甲双胍组83.328±12.444＃＃14.733±1.821＃＃银蓝调脂胶囊高剂量组80.952±8.489＃＃17.851±2.116＃＃银蓝调脂胶囊低剂量组93.667±10.709＃＃18.807±3.071＃＃

3.5 银蓝调脂胶囊对ZDF 大鼠（fa/fa） 肝组织病理形态的影响 如图1 所示，正常组肝细胞肝小叶结构清晰，胞浆红染均匀一致，肝窦清晰可见，肝索排列整齐； 模型组可见肝索排列紊乱，肝细胞肿胀、气球样变，见有大量大小不等的圆形脂滴空泡； 与模型组比较，银蓝调脂胶囊各剂量大鼠肝组织肝窦较为清晰且肝索的排列相对整齐，脂滴空泡的数量也明显减少，非诺贝特＋二甲双胍组大鼠肝组织脂滴空泡明显减少、变小，肝细胞肿胀较轻，肝窦较清晰，肝索排列较整齐。如表5 所示，与正常组比较，模型组大鼠肝组织脂滴空泡面积比例升高（P＜0.01）； 与模型组比较，非诺贝特＋二甲双胍组和银蓝调脂胶囊各剂量组大鼠肝组织脂滴空泡面积比例降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 各组大鼠肝组织HE 染色（×200）

表5 各组大鼠肝组织脂滴空泡面积比例比较（±s，n＝6）

表5 各组大鼠肝组织脂滴空泡面积比例比较（±s，n＝6）

注： 与正常组比较，** P ＜0.01； 与模型组比较，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别脂滴空泡面积比例/%正常组0.239±0.189模型组44.232±9.356**非诺贝特＋二甲双胍组14.836±3.760＃＃银蓝调脂胶囊高剂量组16.686±2.895＃＃银蓝调脂胶囊低剂量组25.552±4.009＃

3.6 银蓝调脂胶囊对ZDF 大鼠 （fa/fa） 肝组织ACC1、FAS、LXRα 蛋白表达的影响 如图2 所示，与正常组比较，模型组大鼠肝组织ACC1 蛋白表达有升高趋势，LXRα蛋白表达有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），FAS 蛋白表达升高（P＜0.01）； 与模型组比较，非诺贝特＋二甲双胍组和银蓝调脂胶囊高剂量组大鼠肝组织ACC1、FAS 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），LXRα 蛋白表达有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），银蓝调脂胶囊低剂量组大鼠肝组织FAS 蛋白表达降低（P＜0.05）。

图2 各组大鼠肝组织ACC1、FAS、LXRα 蛋白表达（±s，n＝3）

4 讨论

高脂血症和2 型糖尿病均是我国乃至全球范围内的常见病、多发病，而且大多数糖尿病患者除了表现出血糖的异常升高之外，往往还伴随有脂质代谢异常的症状［7］。临床上对高脂血症合并糖尿病的治疗主要以降脂药和降糖药联用为主，口服降脂药主要有贝特类、他汀类、烟酸及其衍生物等； 口服降糖药主要有双胍类、DPP-4 抑制剂类、磺脲类、噻唑烷二酮类、α-葡萄糖苷酶抑制剂等［8］。多种药物联用虽然达到一定的降糖降脂效果，但也大大地增加了用药风险。因此，开发同时具有降脂、降糖作用，且毒副作用相对更少、更小的中成药，具有很高的研究与应用价值。

银蓝调脂胶囊由绞股蓝、蜂胶、银杏叶、化橘红组成，具有益气健脾、活血化瘀、祛痰利湿等功效，适用于气虚痰瘀阻痹型高脂血症的治疗。ZDF 大鼠（fa/fa） 是来源于高血糖Zucker 肥胖大鼠的近亲繁殖，由于瘦素受体基因突变，在高脂饲料诱导下，极易引起肥胖、糖尿病，并伴随有胰岛素抵抗及高脂血症［9］，更适合模拟人类糖脂代谢异常。因此，本实验选择ZDF 大鼠（fa/fa） 研究银蓝调脂胶囊对糖脂代谢异常的作用及机制。本实验结果显示，银蓝调脂胶囊能降低ZDF 大鼠血清TG、TC、LDL-c、GLU、HbA1c 水平，升高HDL-C、胰岛素水平，证明其有较好的调血脂、降血糖作用，与临床效果基本相符。

Leptin 由脂肪组织分泌，其在血清中的水平与动物脂肪组织大小成正比，对脂肪分解与运用有着重要的作用［10］。ADPN 由脂肪细胞分泌，是一种胰岛素增敏激素，具有促进骨骼肌细胞脂肪酸氧化和糖吸收的作用，被认为是维持机体脂质及血糖稳态的重要调节因子［11-12］。本实验结果显示，银蓝调脂胶囊能降低ZDF 大鼠血清Leptin 水平，升高ADPN 水平，有助于改善ZDF 大鼠糖脂代谢紊乱状态，这可能是银蓝调脂胶囊调节糖脂代谢的作用机制之一。

糖脂代谢紊乱被认为是一种以慢性高血脂、高血糖和细胞因子水平升高为特征的代谢性炎性疾病，提示炎症在其病因学中起着因果作用。有研究表明，高脂血症、糖尿病与IL-6、Leptin、CRP 和TNF-α 水平的升高密切相关［13-14］。IL-6 可对B 淋巴细胞分化起促进作用，也可通过与其他细胞因子及效应分子产生细胞毒作用，导致胰岛β细胞死亡； TNF-α 参与慢性炎症和多种代谢紊乱，TNF-α的过度表达可造成胰岛素抵抗［15］。本实验表明，银蓝调脂胶囊可降低ZDF 大鼠血清IL-6、TNF-α 水平，提示银蓝调脂胶囊可能通过降低炎症因子水平而起到改善胰岛素抵抗作用，进而调节机体糖脂代谢。

ACC1 和FAS 均是脂肪酸合成的关键酶，而LXRα 是调节胆固醇稳态的固醇敏感转录因子，调控多个组织（如肝脏、小肠、外周血细胞、脑等） 中与脂质合成、运输和排泄相关基因的表达［16］； LXRα 亦是胆固醇逆向转运途径的重要调节因子［17-18］，是决定全身胆固醇水平的重要因素。本实验结果显示，银蓝调脂胶囊有升高肝组织LXRα 蛋白表达的趋势，可降低ACCI 及FAS 蛋白表达，提示银蓝调脂胶囊可通过抑制肝脏脂肪生成相关蛋白，从而减少肝脏中的脂质积累。

综上所述，银蓝调脂胶囊具有一定的降血脂、降血糖作用，能有效改善糖脂代谢紊乱状态，其作用机制可能与改善体内脂质代谢与炎症反应，调控肝组织ACC1、FAS 蛋白表达进而减少肝脏脂质的堆积有关。