汉黄芩素通过调控JNK/AP-1 信号通路对缺血性脑卒中大鼠神经功能障碍、脑组织损伤的影响

2023-10-30徐建奇

中成药 2023年10期

叶维，张红，王莉，徐建奇

（长江航运总医院康复医学科，湖北武汉 430010）

缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）占所有脑卒中病例的80% ～85%，其会引发炎症、氧化应激和细胞凋亡等，造成脑损伤［1］。目前仅存在2 种已获批准的治疗选择，即组织纤溶酶原激活剂和血管内血栓切除术，但较窄的治疗窗和额外损伤的高风险限制了其适用性［2］。因此，探究CIS后脑损伤的新治疗措施具有重要意义。汉黄芩素是从黄芩根中分离出来的天然成分。已有研究报道，其可抑制永久性大脑中动脉闭塞模型大鼠的缺血性脑损伤［3-4］。但关于汉黄芩素减轻CIS 大鼠脑损伤的具体机制尚不完全清楚。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） /激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）可介导脑损伤的发生，抑制该信号通路可改善脑出血后的神经炎症［5］。而汉黄芩素能否通过调控JNK/AP-1 通路影响CIS大鼠神经功能障碍及脑组织损伤尚不明确。因此，本研究主要探究汉黄芩素对CIS 大鼠神经功能障碍、脑组织损伤的影响，以及汉黄芩素的作用机制，旨在为CIS 的临床治疗提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 120 只雄性SD 大鼠，体质量220 ～240 g，购自广东南模生物科技有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （粤） 2022-0062］。本研究经医院动物伦理委员会批准。

1.2 试剂汉黄芩素［货号 YLK-B0292D，20 mg，纯度≥98%，优利科（上海）生命科学有限公司］。丁苯酞（货号CS-B4908，上海莼试生物技术有限公司）； JNK 激活剂Anisomycin （货号T6758，南京赛泓瑞生物科技有限公司）；大鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（货号FKkl1921、YM-SZ1922，上海远慕生物科技有限公司）； TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒［货号KTA2010-1，亚科因（武汉）生物技术有限公司］；JNK1、c-Jun、c-Fos、p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos、β-actin、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（货号 ab110724、ab40766、ab208942、ab47337、ab32137、ab278642、ab6276、ab6721，英国Abcam 公司）。

2 方法

2.1 模型构建大鼠腹腔注射4%戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定于手术台上，在颈正中部作一切口，分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉近心端，在颈总动脉近心端剪一小口，远心端挂线，然后缓慢向颈内动脉插入线栓直至有阻力不能插入为止，回抽少许线栓，结扎颈内动脉，缝合伤口。术后神经功能评分高于1 分且低于4 分则为造模成功［6］。

2.2 分组及给药按照随机数字表法将大鼠分为对照组、模型组、汉黄芩素低剂量组、汉黄芩素高剂量组、丁苯酞组、汉黄芩素高剂量＋JNK 激活剂（Anisomycin）组，每组20 只。对照组大鼠仅切开皮肤、分离血管，不进行拴线处理；其余各组大鼠均按“2.1” 项下方法构建模型。建模成功后，汉黄芩素低剂量组、汉黄芩素高剂量组［7］、丁苯酞组［8］大鼠分别灌胃 0.07 mg/kg 汉黄芩素、0.14 mg/kg汉黄芩素、20 mg/kg 丁苯酞，并腹腔注射等体积生理盐水；汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组［9］大鼠灌胃0.14 mg/kg 汉黄芩素，并腹腔注射5 mg/kg Anisomycin，每天1 次，持续14 d。

2.3 标本收集造模结束后及末次给药12 h 后，所有大鼠均进行神经功能评分。评分后取大鼠脑组织，其中5 个用于脑梗死体积测定，5 个用于脑组织含水量测定，5 个固定于4%多聚甲醛中用于HE染色、TUNEL 染色，5 个保存在液氮中用于Western blot 实验和SOD 活性、MDA 水平检测。

2.4 Zea-Longa 法评价神经功能根据Zea-Longa评分系统［10］对每组20 只大鼠进行神经功能评分，其中0 分为无神经功能障碍症状，1 分为无法伸展对侧前爪，2 分为行走时转向偏瘫侧，3 分为倾倒到偏瘫一侧，4 分为不能自发行走、无意识。

2.5 TTC 染色测定脑梗死体积取各组大鼠脑组织，PBS 洗涤后切成2 mm 切片，于1% TTC 溶液中37 ℃染色30 min，然后在10%甲醛中固定24 h，拍照并测定脑梗死体积，未染色区域被定义为梗死区域。脑梗死体积百分比＝（梗死体积/大脑总体积） ×100%。

2.6 脑组织含水量测定称量大鼠脑组织总湿重，记为W1，置于65 ℃烘箱中烘干24 h，称量其干重，记为W2。脑组织含水量＝［（W1-W2）/W1］ ×100%。

2.7 HE 染色观察脑组织海马CA1 区神经细胞病理变化将大鼠海马CA1 区脑组织于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，清水洗涤4 h，分级乙醇脱水，按照标准组织学程序包埋在石蜡中，切片4 μm，进行HE 染色，在光学显微镜下拍摄海马CA1 区脑组织病理变化。

2.8 脑组织SOD 活性、MDA 水平检测按照试剂盒说明书检测大鼠脑组织SOD 活性、MDA水平。

2.9 TUNEL 染色检测大鼠脑组织神经细胞凋亡取大鼠脑组织石蜡切片，严格按照TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书进行染色，荧光显微镜观察细胞凋亡情况，Image Pro Plus 6.0 软件分析细胞凋亡率。

2.10 Western blot 法检测脑组织JNK/AP-1 信号通路相关蛋白表达大鼠脑组织采用RIPA 裂解缓冲液裂解并提取总蛋白，蛋白定量后进行电泳、转膜、封闭，加p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos、JNK1、c-Jun、c-Fos、β-actin 一抗4 ℃孵育过夜，然后与HRP 偶联的二抗孵育2 h，ECL 法发光、显影，Image J 软件测量蛋白条带灰度值。

2.11 统计学分析通过SPSS 16.0 软件进行处理，数据以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 汉黄芩素对大鼠神经功能评分的影响与对照组比较，模型组大鼠神经功能评分升高（P＜0.05）；与模型组比较，汉黄芩素各剂量组和丁苯酞组大鼠神经功能评分降低（P＜0.05）；与汉黄芩素高剂量组比较，汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组大鼠神经功能评分升高（P＜0.05），见表1。

表1 汉黄芩素对大鼠神经功能评分的影响（±s，n＝20）Tab.1 Effect of wogonin on neurological function score in rats （±s，n＝20）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与汉黄芩素高剂量组比较，△P＜0.05。

组别神经功能评分/分对照组0.00±0.00模型组2.78±0.21*汉黄芩素低剂量组2.15±0.14＃汉黄芩素高剂量组1.37±0.12＃丁苯酞组1.34±0.13＃汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组2.23±0.11△

3.2 汉黄芩素对大鼠脑梗死体积百分比的影响模型组大鼠脑梗死体积百分比高于对照组（P＜0.05）；与模型组比较，汉黄芩素各剂量组和丁苯酞组大鼠脑梗死体积百分比降低（P＜0.05）；与汉黄芩素高剂量组比较，汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组大鼠脑梗死体积百分比升高（P＜0.05），见图1、表2。

图1 各组大鼠脑组织TTC 染色Fig.1 TTC staining of rat brain tissue in each group

表2 汉黄芩素对大鼠脑梗死体积百分比的影响（±s，n＝5）Tab.2 Effect of wogonin on the percentage of cerebral infarction volume in rats （±s，n＝5）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与汉黄芩素高剂量组比较，△P＜0.05。

组别脑梗死体积百分比/%对照组0.00±0.00模型组36.21±3.23*汉黄芩素低剂量组28.13±2.25＃汉黄芩素高剂量组15.62±1.34＃丁苯酞组14.98±1.20＃汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组26.65±2.21△

3.3 汉黄芩素对大鼠脑组织含水量的影响与对照组比较，模型组大鼠脑组织含水量升高（P＜0.05）；与模型组比较，汉黄芩素各剂量组、丁苯酞组大鼠脑组织含水量降低（P＜0.05）；与汉黄芩素高剂量组比较，汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组大鼠脑组织含水量升高（P＜0.05），见表3。

表3 汉黄芩素对大鼠脑组织含水量的影响（±s，n＝5）Tab.3 Effect of wogonin on water content in brain tissue of rats （±s，n＝5）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与汉黄芩素高剂量组比较，△P＜0.05。

组别脑组织含水量/%对照组75.53±4.17模型组95.23±4.11*汉黄芩素低剂量组88.48±4.32＃汉黄芩素高剂量组79.18±4.26＃丁苯酞组79.76±4.22＃汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组87.28±5.88△

3.4 汉黄芩素对大鼠脑组织海马CA1 区神经细胞病理变化的影响对照组大鼠脑组织海马CA1 区神经细胞排列致密均匀，结构形态正常，细胞轮廓清晰，形态完整正常，核仁清晰可见；模型组大鼠神经细胞核萎缩，部分细胞呈点状坏死，神经细胞紊乱；与模型组比较，汉黄芩素各剂量组、丁苯酞组大鼠脑组织海马CA1 区神经细胞病理损伤减轻；与汉黄芩素高剂量组比较，汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组大鼠脑组织海马CA1 区神经细胞病理损伤严重，见图2。

图2 各组大鼠脑组织海马CA1 区HE 染色（×200）Fig.2 HE staining of rat hippocampal CA1 area in each group （×200）

3.5 汉黄芩素对大鼠脑组织SOD 活性和MDA 水平的影响与对照组比较，模型组大鼠脑组织SOD 活性降低（P＜0.05），MDA 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，汉黄芩素各剂量组、丁苯酞组大鼠脑组织SOD 活性升高（P＜0.05），MDA水平降低（P＜0.05）；与汉黄芩素高剂量组比较，汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组大鼠脑组织SOD 活性降低（P＜0.05），MDA 水平升高（P＜0.05），见表4。

表4 汉黄芩素对大鼠脑组织SOD 活性、MDA 水平的影响（±s，n＝5）Tab.4 Effects of wogonin on SOD activity and MDA level in brain tissue of rats （±s，n＝5）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与汉黄芩素高剂量组比较，△P＜0.05。

组别SOD/（U·mg-1） MDA/（nmol·mg-1）对照组67.74±4.052.31±0.22模型组25.58±1.12*8.86±0.42*汉黄芩素低剂量组36.12±2.03＃7.13±0.37＃汉黄芩素高剂量组59.52±2.78＃3.57±0.28＃丁苯酞组59.58±2.84＃3.59±0.25＃汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组 42.34±3.15△5.83±0.27△

3.6 汉黄芩素对大鼠神经细胞凋亡的影响模型组大鼠神经细胞凋亡率高于对照组（P＜0.05）；与模型组比较，汉黄芩素各剂量组、丁苯酞组大鼠脑组织神经细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与汉黄芩素高剂量组比较，汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组大鼠脑组织神经细胞凋亡率升高（P＜0.05），见图3、表5。

图3 各组大鼠脑组织神经细胞TUNEL 染色（×200）Fig.3 TUNEL staining of nerve cells in rat brain tissue of each group （×200）

表5 汉黄芩素对大鼠脑组织神经细胞凋亡的影响（±s，n＝5）Tab.5 Effect of wogonin on neuronal apoptosis in brain tissue of rats （±s，n＝5）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与汉黄芩素高剂量组比较，△P＜0.05。

组别细胞凋亡率/%对照组4.17±0.31模型组39.87±3.06*汉黄芩素低剂量组26.87±2.12＃汉黄芩素高剂量组11.34±1.24＃丁苯酞组11.22±1.08＃汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组28.84±2.31△

3.7 汉黄芩素对大鼠脑组织p-JNK1、p-c-Jun、pc-Fos 蛋白表达的影响模型组大鼠脑组织p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表达高于对照组（P＜0.05）；与模型组比较，汉黄芩素各剂量组、丁苯酞组大鼠脑组织p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表达降低（P＜0.05）；与汉黄芩素高剂量组比较，汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组大鼠脑组织p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表达升高（P＜0.05），见图4、表6。

图4 各组大鼠脑组织p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白条带Fig.4 Protein bands of p-JNK1，p-c-Jun and p-c-Fos in rat brain tissue of each group

表6 汉黄芩素对大鼠脑组织p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表达的影响（±s，n＝5）Tab.6 Effects of wogonin on the protein expressions of p-JNK1，p-c-Jun and p-c-Fos in brain tissue of rats （±s，n＝5）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与汉黄芩素高剂量组比较，△P＜0.05。

组别p-JNK1/JNK1p-c-Jun/c-Junp-c-Fos/c-Fos对照组0.28±0.020.21±0.020.15±0.01模型组0.94±0.05*0.95±0.04*0.89±0.10*汉黄芩素低剂量组0.70±0.07＃0.71±0.06＃0.70±0.06＃汉黄芩素高剂量组0.39±0.03＃0.34±0.03＃0.31±0.03＃丁苯酞组0.38±0.03＃0.32±0.03＃0.30±0.02＃汉黄芩素高剂量＋Anisomycin 组0.74±0.06△0.71±0.06△0.67±0.06△

4 讨论

CIS 被认为是世界上发病率、死亡率和致残率都很高的主要致命疾病之一［11］。脑卒中是全球人类死亡的主要原因，预计到2030 年将增加24.9%［12］。但目前关于CIS 的治疗策略较少，因此，开发新的药物来治疗CIS 引起的脑损伤具有重要意义。改良的线栓法是常用于构建CIS 模型的方法，本研究利用此方法构建CIS 大鼠模型，结果显示，与对照组比较，模型组神经功能评分、脑梗死体积百分比、脑组织含水量、氧化应激水平、神经细胞凋亡率升高，海马CA1 区神经细胞病理损伤严重，表明CIS 模型大鼠存在神经功能障碍及脑组织损伤。

汉黄芩素是黄芩的主要化学成分，是含有苯并吡喃酮的黄酮衍生物，具有抗氧化、抗炎、保护神经等作用［13］。据报道，汉黄芩素可减轻麻醉大鼠创伤性脑损伤的有害影响［14］；也可通过减少细胞凋亡对创伤性脑损伤发挥保护作用［15］。而关于汉黄芩素对CIS 大鼠神经功能障碍及脑组织损伤的影响鲜有报道。本研究显示，汉黄芩素可降低CIS 大鼠神经功能评分、脑梗死体积百分比、脑组织含水量、氧化应激水平、神经细胞凋亡率，可使海马CA1 区神经细胞病理损伤减轻，且汉黄芩素高剂量组与丁苯酞组效果相近，表明汉黄芩素可改善CIS 大鼠神经功能障碍及脑组织损伤。

JNK 和c-Jun 磷酸化是关键的细胞凋亡驱动因素，一旦被激活，他们就可以与c-Fos 和c-Jun 家族的成员共同形成AP-1 来调控细胞凋亡［16-17］。相关研究显示，抑制JNK/AP-1 通路可减少新生儿缺氧缺血性脑损伤后的神经元凋亡并改善运动行为［18］；还可降低缺血再灌注后神经细胞凋亡数，进而保护脊髓组织［19］。本研究显示，与对照组比较，模型组大鼠脑组织p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos蛋白表达升高；与模型组比较，汉黄芩素各剂量组和丁苯酞组大鼠脑组织p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos蛋白表达降低，推测汉黄芩素可能通过抑制JNK/AP-1 通路改善CIS 大鼠神经功能障碍及脑组织损伤。为了验证该猜想，本研究在高剂量汉黄芩素处理的基础上加以JNK 激活剂Anisomycin 干预CIS大鼠，结果显示Anisomycin 减弱了高剂量汉黄芩素对CIS 大鼠神经功能障碍及脑组织损伤的改善作用，证实了汉黄芩素可能通过抑制JNK/AP-1 通路改善CIS 大鼠神经功能障碍，减轻脑组织损伤的作用。

综上所述，汉黄芩素可能通过抑制JNK/AP-1通路改善CIS 大鼠神经功能障碍及脑组织损伤。然而，汉黄芩素对CIS 大鼠神经功能障碍及脑组织损伤的改善作用可能还涉及其它通路，但本研究还未阐明，这将是本课题组后续研究的重点。