一测多评法同时测定小儿香橘丸中8 种成分

2023-10-30王丽琼魏长勇

中成药 2023年10期

王丽琼，魏长勇

（乐山市食品药品检验检测中心，四川省中药质量研究重点实验室，四川乐山 614000）

小儿香橘丸是由苍术、厚朴、陈皮、枳实、甘草等19 味中药制成的大蜜丸，用于治疗脾虚食滞所致的呕吐便泻、脾胃不和、身热腹胀、面黄肌瘦、不思饮食［1-2］，其现行质量标准收载于2020 年版《中国药典》一部，但仅以橙皮苷为指标成分，不能全面准确地评价其质量［3］。中药质量控制提倡全面性［4-7］，故多指标成分测定为直接有效的方法［8-11］。

小儿香橘丸中苍术、甘草为主药，陈皮为辅药，加上枳实、厚朴等药味，全方合用效果显著，符合中医药整体理念。一测多评法以性质稳定、价廉易得的对照品为内标，同时测定其他多种成分的含量，解决了中药对照品昂贵、稀缺、管理困难等问题，在中药材、中药成方制剂质量控制中应用广泛［12-18］。因此，本实验建立一测多评法同时测定小儿香橘丸中苍术素、厚朴酚、和厚朴酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、甘草苷的含量，以期为整体全面地控制该制剂质量提供科学可靠的依据。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置DAD 检测器（美国Agilent 公司）； XSE205 DualRange 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； CQ-100B 超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）； 16K 离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）。SVEATMA585V3 C18Opal、GL Sciences Intersustain AQ-C18、Welch Ultimate LP-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），其中SVEATMA585V3 C18Opal 有3 个批号，分别为18333165、19303361、2111939。

苍术素（批号111924-201806，纯度99.5%）、厚朴酚（批号110729-202015，纯度99.0%）、和厚朴酚（批号110730-201915，纯度99.8%）、新橙皮苷（批号111857-201804，纯度99.4%）、橙皮苷（批号110721-201818，纯度96.2%）、柚皮苷（批号110722-201714，纯度93.4%）、甘草苷（批号111610-201607，纯度93.1%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；芸香柚皮苷对照品（批号G22080134，纯度98.8%）购自坛墨质检标准物质中心。小儿香橘丸（市售，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号 16015845、18015421、15015420、19010678，每丸3 g）。乙腈为色谱纯（北京百灵威科技有限公司）；N-N二甲基甲酰胺为分析纯（成都市科隆化学品有限公司）；磷酸为分析纯［重庆川东化工（集团）有限公司］；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液精密称取苍术素、厚朴酚、和厚朴酚、新橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、甘草苷对照品适量，N-N二甲基甲酰胺制成质量浓度分别为0.22、1.14、0.48、4.25、2.74、2.86、0.34 mg/mL 贮备液；精密称取橙皮苷对照品14.43 mg，置于25 mL 量瓶中，N-N二甲基甲酰胺溶解，制成贮备液，分别精密量取上述7 种贮备液1 mL，定容至刻度，即得（苍术素、厚朴酚、和厚朴酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、甘草苷质量浓度分别为8.90、45.59、19.16、170.17、555.27、109.46、114.29、13.64 μg/mL）。

2.1.2 供试品溶液精密称取本品10 粒，研细，取约6 g，精密称定，加入适量硅藻土研磨均匀，置于具塞锥形瓶中，精密加入N-N二甲基甲酰胺50 mL，密塞，称定质量，超声处理1 h，放冷至室温，N-N二甲基甲酰胺补足减失的质量，摇匀，离心，取上清液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液按本品处方工艺和比例，分别制成缺苍术、缺厚朴、缺陈皮和枳实、缺甘草的阴性样品（其中山药、莲子、薏苡仁、砂仁、白扁豆、六神曲经乐山市食品药品检验检测中心专家鉴定为正品，其他13 味药材均购自中国食品药品检定研究院），按 “2.1.2” 项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件 SVEATMA585V3 C18Opal 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相0.1% 磷酸（A） -乙腈（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长286 nm （厚朴酚、和厚朴酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、甘草苷）、338 nm （苍术素）；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution manners

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验精密量取“2.1” 项下对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰与相邻色谱峰的分离度均符合要求，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察精密称取橙皮苷对照品29.28 mg，置于25 mL 量瓶中，N-N二甲基甲酰胺溶解，精密加入“2.1.1” 项下其他7 种成分贮备液各2 mL，定容至刻度，摇匀，分别精密量取4、3、2、1、0.5 mL，置于5 mL 量瓶中，N-N二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，在“2.2” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，并以S/N ＝10 为定量限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验精密量取“2.1.1” 项下对照品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样测定6 次，测得苍术素、厚朴酚、和厚朴酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、甘草苷峰面积RSD 分别为 1.01%、0.86%、0.74%、0.87%、1.24%、1.31%、1.01%、1.33%，表明仪器精密度较好。

2.3.4 重复性试验取同一批本品，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得苍术素、厚朴酚、和厚朴酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、甘草苷含量RSD 分别为1.82%、1.06%、0.89%、1.36%、1.01%、1.74%、1.85%、1.66%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验取同一份供试品溶液，室温（25 ℃）下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得苍术素、厚朴酚、和厚朴酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、甘草苷峰面积RSD 分别为0.57%、0.85%、0.74%、0.69%、1.25%、0.78%、0.81%、1.02%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验精密称取各成分含量已知的同一批样品约3 g，加入一定量硅藻土，研磨均匀，置于具塞锥形瓶中，精密加入橙皮苷对照品约12 mg 及“2.1.1” 项下下苍术素、厚朴酚、和厚朴酚、新橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、甘草苷贮备液各0.6、0.5、0.6、0.5、0.9、0.5、0.7 mL，按“2.1.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，苍术素、厚朴酚、和厚朴酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、甘草苷平均加样回收率（RSD）分别为101.44% （1.36%）、99.50% （0.93%）、99.26% （1.67%）、101.23%（1.76%）、99.81% （1.91%）、101.71% （1.37%）、100.78% （1.28%）、99.77% （1.66%）。

2.4 相对校正因子计算采用多点校正法，以橙皮苷为内标，计算其他7 种成分的相对校正因子fk/s，公式为fk/s＝fk/fs＝（CkAs） / （CsAk），其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表3。

表3 各成分对校正因子Tab.3 Relative correction factors for various constituents

2.5 耐用性试验精密量取“2.1.1” 项下对照品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，分别考察SVEATMA585V3 C18Opal、GL Sciences Intersustain AQ-C18、Welch Ultimate LP-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）及同一品牌［SVEATMA585V3 C18Opal （250 mm×4.6 mm，5 μm）］不同批号（18333165、19303361、2111939）色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响（RSD＜2%）。

表4 不同色谱柱对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different columns on relative correction factors

2.6 色谱峰定位

2.6.1 相对保留时间法精密量取“2.1.1” 项下对照品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，以橙皮苷为内标，计算其他7 种成分的相对保留时间，按“2.5” 项下方法进行定位，结果见表5，可知该方法稳定性良好（RSD＜4%），能初步定位色谱峰。

表5 各成分相对保留时间Tab.5 Relative retention time of various constituents

2.6.2 紫外光谱辅助法在相对保留时间一致的基础上，本实验从紫外光谱形状、特征吸收波长及其吸光度比值出发进行分析。对照品、供试品溶液色谱图中各成分二极管阵列检测器采集的峰顶点紫外光谱图见图2，可知两者一致。

图2 各成分紫外光谱图Fig.2 Ultraviolet spectrograms of various constituents

各成分紫外光谱特征波长及其吸光度比值见表6，可知供试品溶液色谱图中各成分紫外光谱特征波长均与对照品溶液一致，特征波长吸光度比值亦然。结合图2 发现，新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷均属于黄酮类成分，其紫外光谱图形状、特征波长极其相似，不易分辨，但四者特征波长（286、248 nm）吸光度比值有明显区别，表明该参数可将结构相似物质成分的紫外光谱进行区分，可采用峰/峰、峰/谷、谷/峰、谷/谷等形式。综上所述，紫外光谱形状、特征吸收波长、特征波长吸光度比值层层递进，进一步提高了定性准确度，并且紫外光谱可准确辅助定位色谱峰。

表6 各成分紫外光谱特征Tab.6 Ultraviolet spectral characteristics of various constituents

2.7 样品含量测定取4 批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，每批3 份，在“2.2”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含量，结果见表7，可知2 种方法所得结果接近［相对平均偏差（RAD）＜4%］。

表7 各成分含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab.7 Results of content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 色谱条件选择紫外光谱图显示，5 种黄酮类成分及厚朴酚、和厚朴酚在286 nm 波长处吸收较强，而含量较低的苍术素适合338 nm 吸收峰，故选择286、338 nm 作为检测波长。再比较了SVEATMA585V3 C18Opal、GL Sciences Intersustain AQ-C18、Welch Ultimate LP-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的分离效果，发现 SVEATMA585V3 C18Opal 色谱柱最优，适用于小儿香橘丸中多成分含量同时测定。

3.2 内标选择由于橙皮苷对照品性质稳定，价廉易得，含量较高，色谱峰出峰时间适中，故本实验选择其作为内标。

3.3 色谱峰定位本实验采用相对保留时间法进行色谱峰定位，并且保留时间有偏移或有干扰时紫外光谱常作为辅助方法［19-20］。另外，新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷均属于黄酮类化合物，紫外光谱图极其相似，从形状、特征吸收波长上无法区分，而本实验采用特征波长吸光度比值法，可达到满意的定位效果，从而提高紫外光谱定性色谱峰的准确性。