表面增强拉曼光谱的样品前处理方法研究进展

欧阳磊，朱丽华，帅 琴

1. 中国地质大学（武汉）生物地质与环境地质国家重点实验室，材料与化学学院，湖北 武汉 430074；2. 华中科技大学化学与化工学院，湖北 武汉 430074

表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）是一种基于拉曼光谱的新型光谱技术。由于其具有的高灵敏度、包含丰富的化学信息以及相对简单的前处理及检测过程得到了广泛的关注。SERS 技术已在化学分析、食药快检、生物医学检测、环境监测等诸多领域展示出了重要的应用前景［1］。伴随着纳米增强制备技术的飞速发展，SERS 的检测灵敏度得到了极大的提高，甚至可实现单分子水平的SERS 检测。

基于SERS 技术的分析方法的开发主要包含增强基底制备及配套前处理方法开发两部分构成。历经几十年的快速发展，SERS 基底的设计和构建取得了长足的发展，然而，由于SERS 技术在进行实际应用时，面对的往往是较为复杂的环境和基质，为了避免复杂基质对目标物检测的干扰、同时保证测得结果的准确性，必须针对实际应用情况配套开发针对性的前处理方法。在该领域尽管目前已有不少文献报道，但目前较为全面归纳这类前处理方法的文献较少，为了更好的总结现有的这些前处理技术，本文整理了近几年SERS 前处理领域的研究进展，根据其基本原理对其进行了划分和总结，并对今后值得关注的重点方向进行了展望。

1 SERS 基本原理

1.1 拉曼光谱

当一束光照射至物体表面时，光子可能被吸收、折射、反射，也有可能被散射，少部分光子发生散射后能量会发生变化，这类散射被称为非弹性散射，也称拉曼散射。拉曼散射最早由物理学家Adolf Smekal 从理论上进行了预测，1928 年由印度科学家Chandrasekhahra Raman 在实验上进行证实。拉曼散射中入射光子与散射光子的频率差与入射光子的频率无关，而取决于与入射光子发生作用的物质的分子能级结构，这是SERS 用于物质定性及定量分析的基础。作为一种分子振转动指纹谱，相对红外光谱，SERS 具有更窄的特征峰，由于水分子拉曼活性较低，因此更适于溶液样品的应用。但拉曼散射强度较弱，直接检测时灵敏度较低，导致其局限于材料表征、定性判别等领域，在低浓度物质检测领域的应用较少。

1.2 SERS

SERS 是指当待测物质吸附至某些具有表面等离子体效应或者可与分子之间发生电荷转移作用的材料表面附近时，其拉曼散射强度被增强的现象。该效应由Fleishmann 于1974 年在测定吸附于粗糙化的电极表面的吡啶分子时发现［2］。1977年Jeanmaire 等［3］通过系统的实验和计算证明了上述现象的产生与粗糙银电极表面的电磁场有关。由于SERS 光谱保留了SERS 的指纹谱图特性，同时大大提高了检测灵敏度，因此拓宽了SERS 的应用范围，为分子检测、相互作用研究、生物检测与成像、疾病诊断等诸多领域提供了可实现分子水平监测的新的有效手段。

目前广泛接受的SERS 增强机理主要包含物理增强和化学增强两类。物理增强主要反映了分子与增强基底的表面电磁场之间的相互作用。贵金属等纳米粒子表面存在能够自由移动的电子，当这些电子受到光子照射被激发时会在粒子表面附近形成表面等离子体。当入射光子与等离子体共振频率一致时，可产生局域表面等离子体共振，此时局域电场强度将极大的被增强，产生“热点”。而当分子正好位于热点中时，其拉曼信号可以被显著增强，增强倍数与电场强度的四次方成正比。金、银和铜等金属材料是目前用作SERS 基底最常见的材料，增强强度可达104~108。

化学增强主要来源于分子与基底材料之间发生相互作用，例如形成化学键、络合物或者发生电荷转移等。作用后分子的电子密度发生改变，影响其分子极化率，从而导致拉曼信号被增强。尽管上述增强效应相对物理增强对SERS 强度的贡献较小，但是半导体等无表面等离子体共振的材料等作为增强基底时，化学增强往往其主导作用，其对分子SERS 信号的增强效应也可达102~105［4］。

2 可与SERS 联用的前处理方法

SERS 是分子振转动光谱，原则上不同的分子具有不同的拉曼指纹谱。但在实际检测时，待测分子所处的环境往往非常复杂，这些共存分子不仅导致光谱复杂，而且这些分子还可能影响目标分子与SERS 基底之间的相互作用，降低检测灵敏度甚至导致SERS 基底失效。为了解决基质干扰的问题，可将分析化学中常见的前处理技术结合SERS 技术的特点进行改进和联用。针对不同的样品基质和应用环境，不同的前处理方法可灵活进行选择，本文将常见的、可用于SERS 前处理的方法分为基于疏水浓缩效应的、基于化学识别的、基于生物识别的、基于选择性萃取的和基于色谱分离的前处理方法等几类。

2.1 基于疏水浓缩效应的前处理

对于以贵金属材料为基底的SERS 体系，通常电磁增强效应起主导作用。为了产生更好的增强效果，一方面需要通过构建含有更多“热点”的基底，另一方面需要将目标分析物采用物理、化学甚至生物的方式进行操控，使之进入“热点”中，以便对其拉曼信号增强放大。然而，如何把待检测分子输送到这些“热点”是一大难题。由于疏水材料对液体具有浓缩效应，对于置于其表面的、含有贵金属粒子和目标物的液滴，在蒸发过程中可自由收缩，最后贵金属纳米颗粒和溶液中的待检测分子会浓缩成微米尺度大小的团聚体，该过程中不仅可实现目标物的局部浓缩，而且可将待检测分子运输到纳米粒子团聚形成的“热点”中。基于该策略的SERS 检测方法近年来得到了进一步发展。例如Kao 等［5］基于超疏水的多面体纳米银芯片，实现了尿液中典型健康标志物（葡萄糖醛酸和四氢可的松）的灵敏检测，增强因子可达1012。Zhang等［6］将含有轻质微球的液滴在疏水滑移衬底表面进行蒸发，实现了微液滴在单颗粒表面及颗粒-颗粒颈部的高效浓缩干燥，可实现待测分子的高效浓缩富集（~104富集因子），获得了单分子检测水平的SERS 检测灵敏度。尽管上述方法对目标物的浓缩展现了良好的效果，但该过程中主要基于液体的蒸发收缩效应，对目标物缺乏选择性，当共存基质复杂时，干扰分子也会被浓缩，因此为了实现复杂基质中目标物的选择性识别，基于化学识别作用或生物识别作用的前处理方法也得到了广泛的关注。

2.2 基于化学识别作用的前处理

由于SERS 效应是一种短程效应，现有研究结果表明有效距离通常在10 nm 之内。为了将待测分子选择性的吸附到SERS 基底的有效距离之内，常见的策略是对SERS 基底表面进行功能化，选择性地从复杂的基质中吸附和富集待测物。

针对带电荷的待测物，静电吸附是一种最简单的选择性识别方法。通过制备方法的调控或者修饰使基底表面待上特定的电荷，利用静电吸附作用可吸附带相反电荷的目标物。例如Alvarez-Puebla 等［7］利用不同的氨基酸，作为还原剂制备了Zeta 电位在-60~+30 mV 之间的纳米银，可在不同pH 下实现不同带电性质目标分子如2-萘乙二醇和2-萘甲酸的测定。尽管静电吸附相对简单，但其选择性也较差，容易受到基质中其他带电物质的干扰。

化学识别作用相对静电吸附具有更好的选择性，利用修饰分子与待测物之间选择性的化学识别作用，例如疏水作用、π-π 作用等可实现待测物的富集。例如，基于硫辛酸与多环芳烃的化学亲和作用可以实现荧蒽的高效富集和检测［8］；基于3-巯基-2-丁酮与硝基化合物形成Janowsky 化合物可实现多种硝基炸药的选择性检测［9］。近期，Leong 等［10］基于多种修饰分子与多种目标物的分子相互作用导致的特征性拉曼信号变化，结合机器识别算法，实现了多种目标分析物的高灵敏度、高选择性识别。主客体作用是一种特殊的化学识别作用，主要利用具有疏水性空腔的特殊分子例如环糊精、葫芦脲等选择性地吸附疏水性及分子大小合适的客体分子，选择性较高，同时通过调控空腔大小和结构，可实现不同客体分子的识别［如图1（a）所示］［11］。例如笔者利用β-环糊精作为修饰分子，利用主客体识别作用，成功地实现了环境水体中多种磺胺类抗生素的测定［12］。Taylor 等［13］利用葫芦脲作为修饰分子，将纳米金组装为二聚体和链状多聚体，其疏水腔通过主客体识别作用吸附目标分子，可使分子精准的进入增强热点中，产生很好的SERS 增强效果。近年来，含有规整孔结构的金属骨架化合物由于其对特殊分子独特的选择性也得到了广泛关注，同样也可用于选择性检测。例如ZIF-8 表面吸附H2S 会导致其Au-Br 拉曼峰强度变化，可用于H2S 的间接检测［14］。除此以外，分子印迹技术也是一种具有良好选择性的分子识别技术，其主要采用待测分子或者结构类似的分子作为模板，经高分子交联后洗脱模板，利用洗脱后的空腔选择性的吸附目标分子［如图1（b）所示］［15］。Ashley 等［16］利用带有分子印迹高分子膜修饰的磁性粒子对复杂基质中的目标物进行选择性富集，对猪血浆中痕量氯唑西林的检出限可低至7.8×10-12mol/L。将分子印迹技术与其他富集技术如电富集联合，还可进一步提高对带电目标物的选择性富集和检测能力。例如Yang等［17］将分子印迹膜修饰的纳米金和MoS2修饰的丝网印刷电极结合，利用电动力学富集和分子印迹富集的双重富集作用，实现了带电的邻苯二甲酸酯类增塑剂如邻苯二甲酸二甲酯的痕量选择性检测。

图1 几种选择性识别技术的示意图：（a）主客体作用［11］，（b）分子印迹技术［15］，（c）DNA 碱基互补配对［21］，（d）免疫识别作用［22］Fig.1 Schematic illustration of some selective capture strategies：（a）host-guest interaction［11］，（b）MIPs adsorption［15］，（c）DNA complementary base pairing［21］，（d）immunologic recognition［22］

2.3 基于生物识别作用的前处理

生物体系中选择性识别作用诸如DNA 碱基互补配对［图1（c）］［18］、免疫识别［图1（d）］［19］等往往具有非常高的选择性和抗干扰能力，这类原理已被广泛的用于临床诊断等领域，将这类识别作用与SERS 技术结合，可提高对目标物的选择性测定能力。例如利用抗体-抗原、生物素-亲和素的免疫识别作用，开发基于SERS 技术的免疫检测试剂盒，可实现多种生物标志物的检测，例如癌细胞、癌症因子、致病菌等。由于这类生物分子本征SERS 活性较弱，SERS 免疫检测往往利用带有拉曼标记的结构通过免疫识别与待测物形成夹心结构，用以标记待测物分子，从而实现待测物的间接定量。利用DNA 互补碱基配对这一高选择性的作用机制，可实现DNA 的灵敏检测。2002 年，Cao等［20］首次报道了根据碱基互补配对原理，利用待测DNA 与固定基板及带有拉曼探针分子和经设计的DNA 链的拉曼增强粒子选择性的形成夹心结构，可实现目标DNA 或者RNA 的灵敏测定。更重要的是，通过调整拉曼探针分子和修饰的DNA序列，可同时实现多目标物的同时检测，由于拉曼峰相对于荧光谱峰极窄（< 1 nm），因此同一光谱窗口可以实现更多目标物的同时检测。根据这一原理，SERS 技术已实现了复杂生物基质中各种痕量致病菌DNA 以及疾病标志物DNA 的灵敏检测。将免疫识别与微流控芯片结合，还可实现待测物选择性识别、富集以及检测的自动化，对于临床疾病诊断具有重要的意义［21］。

核酸适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合，因此可用作特殊配体的选择性识别。适配体适配对象相当广泛，不仅包括了生物大分子（如溶菌酶、致病菌）、化学小分子（如多氯联苯），甚至某些无机离子（如Hg2+）都可筛选到相应的适配体。Gao 等［22］利用金黄色葡萄球菌与其适配体的识别作用，成功地实现了金黄色葡萄球菌的SERS 检测，检出限可低至1.5 cfu/mL。

2.4 基于选择性萃取的前处理

萃取是一种常见的从复杂基质中提取目标物的方法，除了最常见的液液萃取、固相萃取、固相微萃取等技术以外，表面萃取、膜萃取技术均可与SERS 技术进行联用［23］。陈丹等［24］使用分散液液微萃取处理烟叶样品，结合固定于双面胶带表面的纳米金实现了烟叶中仲丁灵的检测。采用硫酸铵-乙醇双水相萃取体系，我们成功地实现了血液和组织中药物肝标志物马兜铃酸及其代谢产物的高效萃取和SERS 检测［25］。Markina 等［26］将固相萃取剂CaCO3与纳米金进行复合，将待测物从基质中分离后，酸洗去除萃取剂，即可实现待测物磺胺二甲氧嘧啶的解吸和SERS 测定。将表面修饰有分子印迹膜的磁性粒子填充至固相萃取小柱中，Feng 等［27］实现了果汁中痕量噻苯达唑的萃取和灵敏检测。相比于固相萃取，固相微萃取技术集采样、萃取、浓缩、检测于一体，大大加快了分析检测的速度。将该技术与SERS 技术联用，能更充分地利用SERS 检测快速方便、样品使用量少的特点。基于功能化修饰的磁性纳米粒子易于回收分离的特点而开发的磁固相萃取技术，也可与SERS结合进行应用［28］。例如Yu 等［29］利用磁性粒子吸附待测物，再采用磁性的固相微萃取针对磁性粒子进行分离回收，冲洗后即可原位进行SERS 检测［图2（a）］。该方法可实现红酒中非法添加的枸橼酸西地那非的灵敏检测，检出限可低至10-8mol/L。

图2 常见的可用于SERS 的萃取技术：（a）固相微萃取-SERS 技术检测保健酒中的枸橼酸西地那非的流程图［29］，（b）磁固相萃取-SERS 技术用于果皮表面杀虫剂检测的流程图［30］Fig.2 Typical commonly used extraction strategies in SERS：（a）detection process for Sildenafil citrate in health wine by solid phase microextraction-SERS method［29］，（b）detection procedures for pesticides on fruit peel by surface magnetic solid-phase extraction-SERS method［30］

上述萃取方法大多适用于检测分子存在于溶液中的情况，萃取后与基底混合简单，而对于本身存在于固体表面的待测物，例如果蔬表面的农残、织物表面的颜料、甚至是安检中遇到的指纹表面的毒品、爆炸物残留等，则难以将其定量转移至溶液中。为了实现这类样品的快速准确检测，表面萃取技术具有独特的优势。该技术主要通过采用合适的溶剂将待测物萃取出待测的表面，随后通过将SERS 增强粒子直接原位滴加至该表面或者采用柔性SERS 传感器以贴附的方式吸附萃取液，实现待测物的测定。如Liu 等［30］将Fe3O4@氧化石墨烯@Ag 粒子滴加至果皮表面对农残分子进行萃取和吸附，经磁富集后即可进行SERS 检测［图2（b）］，对福美双的检出限可低至0.48 ng/cm2。Platania 等［31］采用琼脂-银凝胶吸附表面萃取溶液的方式实现了织物表面染料泰利安紫的无损分析。采用表面萃取-配位转移策略，我们利用柔性纳米阵列型SERS 基底成功地实现了果蔬表面痕量福美双及硫磷类农药的萃取和SERS 检测［32］。将这类膜状的基底与气体采集装置结合，构建类似“电子鼻”的气体传感器，可对气相目标物如挥发性醛进行选择性富集和检测。Xia 等［33］将金属骨架化合物固载至膜上，利用其孔结构选择性地保留和富集气相醛类分子，再基于醛与氨基的特征反应产生特征拉曼光谱峰的变化实现了呼吸气中挥发性醛类分子的灵敏检测。

支撑液膜萃取是一种新型萃取技术，其基本原理是通过将疏水性微孔高分子聚合物支撑体浸在溶解有机载体的膜液中，在表面张力作用下膜液充满支撑体微孔而形成支撑液膜；以其为料液相与反萃相提供分隔界面，料液相中的待测物在膜的一侧表面被膜液中的有机萃取剂萃取，在支撑体微孔内扩散传递至膜另一侧表面，再被反萃而实现分离。支撑液膜具有传质面积大、选择性强、分离效率高的特点，将其与SERS 技术联用，可实现复杂基质中待测物的高通量萃取和测定。Moreli 等［34］将该前处理技术、微流控技术及SERS检测结合，组合成集萃取、富集、检测于一体的装置，成功地检测了复杂基质中细菌代谢产物，对目标物可浓缩13 倍以上。

2.5 基于色谱分离的前处理

色谱分离技术在现代分析科学中占有极其重要的地位，而将色谱技术与SERS 传感器进行联用，有望提高SERS 技术在面对实际复杂基质时的检测能力。直接将液相色谱或气相色谱技术与SERS 技术联用时，SERS 相当于一种新型检测器，可检测分离后物质特征的拉曼信号。Subaihi等［35］将经液相色谱分离后的溶液与纳米粒子混合，并采用拉曼光谱仪进行检测，实现了在线液相色谱-SERS 联用［图3（a）］。Xiao 等［36］基于该技术，对肿瘤裂解物的代谢物进行在线检测，结果表明，这种方法的检测性与最先进的液相色谱-质谱联用技术相当，基于拉曼指纹谱建立代谢物的条形码，还可以区分不同的肿瘤模型。类似地，将气相色谱、毛细管色谱以及最新的纸喷雾电离质谱与SERS 联用的技术都有报道。将纳米银负载至毛细管电泳柱中，Prikryl 等［37］报道了毛细管电泳-SERS 联用技术。上述技术成功实现了色谱与SERS 的联用，但是在这些技术中，SERS 仅作为一种不同于常规二极管阵列或者荧光、质谱的一种检测器。尽管可作为上述检测器的一种补充，但这些色谱技术本身对样品前处理要求较高，导致SERS 技术方便快捷的特点难以体现。相反，一些相对简单、但易于实现快速、实地使用的色谱分离技术比如薄层色谱、纸色谱或侧流层析等技术，更加适合于与SERS 技术联用。

图3 几种代表性的与色谱分离联用的SERS 检测策略：（a）用于甲氨蝶呤及其主要代谢产物检测的高效液相色谱-SERS 联用技术［35］，（b）用于水中芳香族化合物现场检测的薄层色谱-SERS 联用技术［38］，（c）一种适用于临床使用的可与侧向层析分析联用的便携式拉曼光谱仪［42］，（d）实现两种核酸同时检测的基于侧向层析-SERS 技术［40］Fig.3 Representative SERS detection methods combined with chromatographic separation strategies：（a）HPLC-SERS for detection of methotrexate and its major metabolites［35］，（b）TLC-SERS for on-site detection of substituted aromatic pollutants in water［38］，（c）portable SERS reader for lateral flow assays in clinical chemistry［42］，（d）simultaneous detection of dual nucleic acids with LFA-SERS［40］

薄层色谱，或称薄层层析，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离的一种层析分离技术。由于商用薄层板价格低廉，而且可通过吸附或者原位生长的方式负载贵金属纳米粒子，形成复合型SERS 基底，这种玻片式的基底可方便地使用便携式拉曼光谱仪进行检测。Li 等［38］报道了薄层色谱-SERS 用于环境水体中多种芳香类有机污染的分离和SERS 检测［图3（b）］。上述策略还被用到反应监测、织物表面染料成分分析以及食品添加剂检测中。以滤纸为分离材料的纸色谱同样可以用于复杂成分的分离，而相对于层析色谱板，柔性纸材料具有功能化更加简单，使用更加灵活，容易贴合至待测表面的特点。例如Zou 等［39］基于色谱纸的分离性能，成功实现了婴儿血液样本中胆红素的分离和灵敏检测。

在生物检测中，还有另外一类以纸为分离材料的检测方式，即侧流免疫层析技术。该技术主要基于免疫识别或者核酸杂交原理，基于待检测物中各组分（化学小分子、抗原、抗体、蛋白质、核酸等）在纸纤维的毛细管作用力下移动的速度差异，在层析膜上实现分离。侧流层析-SERS 技术利用高灵敏度和高特异性的SERS 检测探针代替传统的胶体金或化学发光试剂，克服了传统胶体金侧流免疫层析技术定量不准确和灵敏度低的问题。通过选择不同的识别元件和拉曼探针，还可实现多目标物的同时检测［图3（d）］［40］。该技术在生物标志物如DNA，致病菌、环境污染物等检测中都有很好的表现。针对复杂基质如血液样品，还可将血浆分离膜等功能性的材料与试纸条结合，实现全血样品的直接分析检测［41］。Tran 等［42］根据侧流试纸检测区为二维条状区域的特点，设计了具有线性激光束的、大小仅为火柴盒大小的便携式拉曼光谱仪［图3（c）］，可以在数秒内完成整个检测区信号的采集，展示出了该技术在实际检测中良好的应用前景。

3 总结和展望

SERS 技术作为一种痕量分析技术发展至今，其广泛的应用范围已毋庸置疑，极高的灵敏度、方便的检测过程、使用小型化的仪器设备等特点使其在多种应用环境展示了挑战传统检测方式的可能性。但这些特点也带来了相应的困扰，例如极高的灵敏度通常是面对“标准溶液”时才能获得，对于实际复杂样品干扰往往导致分析性能下降；方便的检测过程是在不考虑样品前处理时的情况，而实际应用时往往不得不妥协于耗时且复杂的样品处理过程。SERS 技术在真正走向实用之前，针对不同的应用环境，结合具体检测对象的特点，开发相应的检测策略，特别是合适的样品前处理方法尤为重要。

在总结上述具有代表性的研究工作的过程中，我们也归纳了一些值得进一步研究的问题，通过对这些问题的深入研究，必将进一步提高SERS技术的实用性。

多组分待测物共存时选择性测定的问题。现有报道的方法大多针对单一组分，如何实现多目标物共存时的同时准确定量仍是一大难题。对于上述问题，可能的解决思路在于通过前处理方法或者对基底的修饰赋予方法对多种目标物的选择性，例如使用适配体等高选择性的功能化物质，可实现特定种类待测物的测定，通过调整上述功能化物质，实现多种待测组分的同步测定。若待测组分化学结构类似，仅靠单组分工作曲线很难满足定量问题，此时需要结合化学计量学［43］等数学手段对光谱信息进行深入挖掘，结合机器学习等技术，对肉眼难以区分的信息建立定量方法。

标记法与非标记法的取舍。对于SERS 活性的目标物往往采用非标记法进行检测，即直接检测待测物的本征拉曼信号对其进行定量。上述方法的好处在于拉曼光谱具有指纹性，因此检测结果的假阳性率较低，对于单组分待测对象，定量也相对简单。但是上述方法要求待测对象必须有一定的SERS 响应，同时与基底有较强的相互作用。而实际检测过程中，待测物可能并不满足上述条件，因而必须采用标记法。采用标记法的好处在于可利用不同的探针分子分别实现不同物质的检测，选择互不干扰的分子和识别单元，可实现多组分物质的同时测定。例如文献［44］就报道了采用含炔基的拉曼探针分子，可同时实现多种物质的无干扰检测和成像。此方法的应用关键在于如何将待测物的浓度信息与探针分子的浓度建立对应关系。

样品前处理-富集检测自动化装置的构建。为了实现SERS 技术的实际应用，所开发的检测策略必须能够在非实验室条件、使用小型化设备、无需专业人员等情况下进行，同时检测准确性、重现性等必须满足实际应用需求。检测试剂设备的模块化、标准化以及检测过程的流程化都是SERS 走向实际应用必须解决的问题。由于检测对象和检测方法的多样性，我们认为现有条件下SERS 技术更有望在开发专一性检测设备的条件下，逐步走向更为广泛的应用，因此成套的前处理模块-SERS增强模块-小型化检测模块是今后值得注意的研究方向。

相信随着更加深入的了解和更广泛的应用尝试，SERS 技术除了在界面分析、生物医学成像等前沿领域发挥重要作用以外，也必将走入寻常百姓家，成为一种得到广泛应用的检测技术。