双胎妊娠中无创产前检测的胎儿游离DNA浓度特征及检测失败原因分析

钟佳通 胡亮 温丽娟 李双武 陈晓杭 裴元元 刘维强*

（深圳市龙岗区妇幼保健院／汕头大学医学院龙岗妇幼临床学院中心实验室，广东深圳，518172）

随着我国全面放开了二胎政策以及辅助生殖技术的不断发展和普及，双胎妊娠率逐年升高。既往研究显示，双胎妊娠容易出现流产、早产、胎盘功能不全、胎儿缺氧和染色体异常等问题［1，2］。双胎妊娠孕妇的产前筛查和咨询极为重要，尽早发现异常可以提供更好的医疗干预和治疗。无创产前筛查（noninvasive prenatal testing，NIPT）是一种通过高通量测序分析孕妇血液中胎儿游离DNA（cellfree fetal DNA，cffDNA）来筛查胎儿染色体非整倍体异常的高精确度产前筛查技术。目前在临床上被广泛应用于单胎妊娠的13、18、21染色体非整倍体的筛查，具有很高的灵敏度和特异度（检出率可达98%），已成为单胎妊娠常规筛查的重要工具［3-4］。随着全基因组大规模并行测序的快速发展和广泛应用，NIPT对双胎妊娠的筛查也已广泛应用于临床。由于双胎妊娠具有不同于单胎妊娠的独特生物学和遗传特征，NIPT对于双胎妊娠的筛查效果仍有待进一步的探讨和总结［5］。本研究以在本院接受行NIPT检测孕妇作为研究对象，分析NIPT双胎妊娠时的检测效率，并与单胎妊娠的筛查情况作比较，探讨NIPT在双胎妊娠染色体非整倍体异常筛查的临床价值，旨在为双胎妊娠的NIPT筛查在临床上的应用和遗传咨询提供更多的参考和理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2017年11月至2023年6月在深圳市龙岗区妇幼保健院行遗传咨询，选择接受NIPT产前筛查的1685例双胎孕妇和109784例单胎孕妇。纳入标准：超声检查显示确定为双胎妊娠的孕妇；经过遗传咨询并签署知情同意书。排除标准：夫妇一方已知明确染色体异常；染色体异常分娩史；1年内接受过异体输血、移植手术、干细胞治疗或免疫治疗者等；胎儿超声结果提示有结构异常需行产前诊断；孕期合并恶性肿瘤；医生认为有明确影响结果的其他情形。本研究已经通过中国人类遗传资源采集审批（2023SLCJ1401），并通过医院伦理审批（LGFYYXLLL-2022-024）。

1.2 NIPT检测 采用联合探针锚定聚合测序法试剂盒（华大智造）在BGISEQ-500测序平台进行全基因组大规模平行测序。用EDTA抗凝管抽外周血5 ml，经低速1500G离心10 min后，吸取血浆再高速15000G离心10 min后二次分离血浆，取200 ml血浆应用磁珠吸附法提取游离DNA并纯化，然后进行末端修复、连接分子标签和PCR构建文库将各样本文库定量混合，再将混合后的文库进行单链环化DNA、滚环扩增，加载于芯片上，最后在BGISEQ-500测序仪上进行联合探针锚定聚合测序。所有NIPT样本的建库过程均未采用DNA富集技术。使用BGI Halos分析系统进行数据分析，通过序列对比获得每条染色体的有效DNA序列条数，计算各染色体的Z值，参照标准化来判断染色体是否异常。使用BGI Halos计算cffDNA浓度。cffDNA浓度低于3.5%、GC含量超过42%、有效数据量低于3.5M或异常染色体数量超过3个被认为检测不合格，其中第一次采血检测因GC含量超过42%、有效数据量低于3.5M或异常染色体数量超过3个检测失败的进行重建库，再次检测不合格进行第二次重新采血检测。第二次采血仍检测不合格定义为最终检测失败。

1.3 统计学方法 本实验数据采用R4.3.1软件进行统计分析，符合正态分布计量资料以x-±s表示，选择两独立样本t检验或Mann-Whilney秩和检验进行比较；计数资料比较采用Pearson X检验或Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。NIPT检测结果灰区定义为目标染色体Z值在［1.96，3）之间。

2 结果

2.1 入组孕妇特征 2017年11月至2023年6月在深圳市龙岗区妇幼保健院选择接受NIPT检测共计1685例双胎妊娠孕妇和109784单胎妊娠孕妇，1685例双胎妊娠孕妇年龄平均值为（30.39±4.73）岁，平均孕周（15.81±2.64）周。109784单胎妊娠孕妇年龄平均值为（29.39±4.59）岁，平均孕周（16.72±3.13）周。双胎妊娠孕妇的平均年龄大于单胎妊娠孕妇，平均孕周小于单胎妊娠孕妇，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 NIPT检测情况

2.2.1 检测流程 对纳入本研究的1685例双胎妊娠孕妇和109784单胎妊娠孕妇行NIPT检测，检测流程见图1。

图1 NIPT检测流程图

图2 cffDNA分析结果

2.2.2 检测完成情况 1685例双胎妊娠孕妇行NIPT检测第一次采样检测成功1645例（97.63%，1645／1685），检测失败40例（2.37%，40／1685），检测失败的原因主要为cffDNA浓度过低总计有35例（2.07%，35／1685）。第一次采血检测失败的40例双胎妊娠孕妇通知第二次重采血行NIPT检测仍然检测失败16例（0.95%，16／1685），其中因cffDNA浓度低失败14例（0.83%，14／1685）。最终1685例双胎妊娠孕妇中16例未能检测成功，最终失败率0.95%（16／1685）。109784例单胎妊娠孕妇行NIPT检测第一次采样检测成功108519例（98.85%，108519／109784），检测失败1265例（1.15%，1265／109784），检测失败的原因主要为染色体Z值处于灰区和胎儿cffDNA浓度低，1265例单胎妊娠孕妇通知第二次重采血行NIPT检测仍然检测失败449例，其中因cffDNA浓度低失败262例（0.24%，262／109784）。最终109784例单胎妊娠孕妇中449例未能检测成功，最终失败率0.41%（449／109784），单胎妊娠的最终失败率低于双胎妊娠，差异具有有统计学意义（P＜0.05），见表1，表2。

表1 1685例双胎妊娠孕妇NIPT检测失败情况

表2 109784例单胎妊娠孕妇NIPT检测失败情况

2.3 双胎妊娠中的cffDNA浓度 双胎妊娠及单胎妊娠孕妇的外周血cffDNA浓度整体趋势均随着孕周的增长而升高。在相同孕周下双胎妊娠孕妇的cffDNA浓度个体差异性较单胎妊娠更大，且整体cffDNA浓度比单胎妊娠的更高（P＜0.05），见图1A、图1B。

本研究1685例双胎孕妇外周血cffDNA浓度在0.84%～41.22%，平均cffDNA浓度为（10.30±4.75）%。109784单胎妊娠孕妇外周血cffDNA浓度均在0.94%～49.83%，平均cffDNA浓度为（9.52±3.92）%。单胎妊娠的孕妇外周血cffDNA浓度分布集中于平均值附近范围，双胎妊娠的孕妇cffDNA浓度分布较单胎妊娠的孕妇更加分散，见图1C。

35例双胎妊娠孕妇第一次因cffDNA浓度较低（＜3.5%）导致检测失败，电话通知重取样再次行NIPT检测，仍有14例因cffDNA浓度较低导致检测失败，且这35例双胎妊娠孕妇两次采样的整体cffDNA浓度变化不大，见图1D。

2.4 双胎妊娠孕妇NIPT检测结果 1669例NIPT检测成功的双胎妊娠孕妇中，共计1658例检测结果提示低风险，随访至出生后三个月，未出现假阴性。11例检测结果提示高风险，筛查阳性率为0.66%（11／1669），其中1例提示为13三体高风险，6例提示为18三体高风险，4例提示为21三体高风险。对NIPT提示高风险的双胎妊娠孕妇进行遗传咨询和产前诊断，染色体核型结果显示，确证1例13三体高风险、3例18三体高风险、3例21三体高风险，阳性预测值分别为100%、50%和75%。复合阳性预测值为63.63%（7／11）未发现漏检的假阴性孕妇，阴性预测值为100%。

3 讨论

本研究基于大样本量NIPT结果，对1685例双胎妊娠及109784例单胎妊娠中的胎儿游离DNA浓度和检测失败原因进行了分析，并进一步探讨了双胎妊娠对三大目标染色体的筛查效果。在本研究基于的研究对象为全妊娠人群，即不具有NIPT技术不适用情形的孕妇均被纳入筛查范围。在此基础上获得的人群数据具有更广泛的代表性。

cff DNA浓度是NIPT的重要质控参数［6］，通常通过男胎Y染色体比例或利用深度学习算法对母胎游离DNA来源分布差异进行建模并预测，如SeqFF等［7］。cffDNA浓度对于NIPT的准确性有至关重要的意义。国内外大量研究表明cffDNA浓度高于3.5%～4%时，NIPT分析结果才具有意义［8，9］。本研究使用的BGI seq500平台采用3.5%作为cff DNA浓度的质控阈值。影响cffDNA浓度的因素较复杂，包括孕周、母体因素、胎儿因素、胎盘因素等［10］。本研究中的双胎妊娠cffDNA浓度呈现三个特点：①cffDNA浓度总体较单胎妊娠高；②分布较宽；③个体差异较单胎妊娠更大。单双胎妊娠的cff DNA浓度在20周左右开始均随孕周增加而明显上升，其中双胎妊娠上升的更早。由于胎儿游离DNA主要来自胎盘滋养层细胞［11］，胎盘的发育情况和胎盘面积往往与cffDNA浓度相关，因此双胎妊娠可具有较高的cffDNA浓度。但双胎妊娠中胎盘面积受绒毛膜性的影响，并可能存在胎盘融合、发育不均等现象，因此双胎妊娠的cff DNA浓度分布较宽［12］。Yang Zhou等报道发现孕妇外周血cffDNA浓度会随孕周增加而升高，但增长速度不一致，从孕10周到孕21周，cffDNA浓度每周升高0.1%，孕21周之后每周升高1%［13］。本研究进一步发现，双胎妊娠cffDNA浓度在18周左右即开始明显增高，而单胎妊娠则约在22周开始上升，较双胎妊娠更晚。

NIPT在双胎妊娠中的检测失败总体较单胎妊娠高，标本cffDNA浓度不足是检测失败的主要原因。由于cffDNA浓度在双胎妊娠中具有较大分布宽度，因此双胎妊娠更易发生cffDNA浓度过低。本研究发现相较于单胎妊娠，双胎妊娠因cffDNA低而导致检测失败的比例要明显更高。这也是双胎妊娠在临床应用中作为慎用指征的原因之一。Yaron等的研究显示，NIPT的检测失败率大约为0.12%～8.09%［14］。Palomaki GE等的一项研究结果显示当孕妇外周血的cffDNA浓度＜4%时，将会极大的影响NIPT的检测，较低的cffDNA浓度会加剧cffDNA受到母体DNA的影响，使得在NIPT测序过程中无法准确识别到cffDNA，导致检测失败［15］。本研究中40例双胎妊娠孕妇在知情同意的情况下进行第二次采血重新行NIPT检测，仍有14例因cffDNA浓度较低而检测失败，成功率与Kinnings SL等研究接近［16］。同时值得注意的是，双胎妊娠较单胎妊娠少发生检测灰区，这一原因尚不完全明确，可能与检测平台所用得到生物信息学算法针对双胎进行了优化所致。除此之外，有效数据量不足和GC含量过高也是导致检测失败的原因，主要可能与实验操作有关，通过复查可避免。多染色体异常导致检测失败原因尚不明确，可能于孕妇本人存在体细胞嵌合等因素有关［17］。

本研究通过随访双胎妊娠产前诊断结果发现，双胎妊娠同样具有的较高的阳性预测与阴性预测值，有良好的临床应用价值。但由于阳性样本量较少，暂无法与单胎妊娠比较。由于双胎妊娠的胎儿游离DNA浓度具有上述特点，且检测失败率较高，临床应用时是需向受检者明确这些局限性和可能存在的假阳性、假阴性风险。本研究还存在一些局限性，例如未探讨双胎妊娠中不同绒毛膜性对胎儿游离DNA及检测失败率的影响，未对假阳性的发生原因进行验证，可在后续研究中进一步完善。

综上，NIPT在双胎妊娠中具有较好的临床应用价值，但更易存在因胎儿游离DNA浓度不足导致检测失败的情形，在临床应用中需向受检者完善知情同意，阐明NIPT在双胎妊娠检测中的局限性。