cffDNA浓度低NIPT检测失败样本的相关因素和妊娠结局分析

杨洁霞 王东梅 侯亚萍 郭芳芳 彭海山 胡听听 吴菁*

（广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东广州，511442）

自从1997年Lo提出发现胎儿游离DNA（cell free fetalDNA，cffDNA）以来［1］，基于胎儿游离DNA无创产前检测打开了产前筛查新路径，改变了传统产前血清学筛查模式。NIPT检测明显提高了产前筛查效率降低假阳性率，对常规21三体／18三体／13三体-综合征复合阳性预测值可达66.73%以上［2-3］，假阳性率小于0.3%，漏诊风险约0.01%［4］。有报道NIPT的敏感性和阳性预测值与cffDNA浓度有明显相关性，随着cffDNA浓度升高敏感性和阳性预测值也随之增高。为减少漏诊，大部分实验室设置了cff DNA浓度最低报告范围，一般以cff DNA浓度＞3%或4%为最低可报告下限［5］。当cffDNA浓度低于这些水平时，大多数实验室会将结果归类为不可报告，从而归类为检测失败。

胎儿cfDNA是由胎盘滋养层细胞凋亡释放到母体外周血，其数量和质量反映了胎盘的生长和功能；一个小的或功能不良的胎盘可能与非整倍体和一些不良的产科和围产期结局有关，如高血压、胎儿生长受限和早产。子痫前期、胎儿生长受限等胎盘源性疾病可能影响胎盘滋养层细胞的凋亡释放cf DNA，从而导致外周血cffDNA浓度低，导致NIPT检测失败，随着血浆cfDNA的研究与技术的发展，血浆cfDNA已被发现与妊娠相关疾病如子痫前期、胎儿生长受限等相关，甚至可以作为疾病是否发生的预测指标［6-7］。

也有研究认为cffDNA浓度低可能增加潜在胎儿非整倍体风险，最近的一项系统综述发现，近四分之一的非报告结果与潜在的胎儿非整倍体或三体相关。除了妊娠并发症的高风险外，cffDNA浓度低检测结果也与胎儿非整倍体本身的风险增加有关。例如，在13三体和18三体，以及X单倍体和三倍体的妊娠中，cffDNA浓度水平较低，尽管在所有研究中并不一致。Rava等人在他们的研究中发现，与整倍体胎儿相比，胎儿有21三体时的平均cffDNA浓度更高，而当胎儿有13三体、18三体或X单体时的平均cffDNA浓度更低［8］。Peter等的回顾和荟萃分析结果认为应重视cffDNA浓度低不可报告结果的产前管理。面对cffDNA浓度低不可报告结果的孕妇应被告知胎儿染色体畸变的风险增加，但不应告知21三体［9］。

本研究拟总结分析cffDNA浓度低NIPT检测失败样本的相关因素和妊娠结局，为该类病例的临床遗传咨询提供参考证据。

1 对象和方法

1.1 对象 回顾性收集2017年1月至2022年7月期间选择本院产前诊断中心接受NIPT检测孕妇。本研究纳入标准为经两次采血均因cffDNA浓度低检测失败样本，排除标准为妊娠结局失访样本。符合入组标准孕妇均接受了详细的临床遗传咨询并建议进行介入性产前诊断和定期超声监测胎儿生长发育。收集孕妇临床资料、产前诊断情况、孕期超声检查结果、孕期并发症、妊娠结局等资料综合分析。该研究得到了广东省妇幼保健院医学伦理委员会（ID 2013102301）的正式批准。

1.2 方法

1.2.1 样本采集及处理 孕妇知情同意后，EDTA抗凝管采集其外周血10ml，6h内分离血浆，具体流程为：4℃、1600G离心10min，取上清血浆，16000 G离心10min，分离上清血浆至EP管中。按照试剂盒说明书提取血浆中游离DNA并构建文库，在末端修复后进行DNA富集技术构建文库［10］，选用胎儿染色体非整倍体试剂盒（T21，T18，T13）试剂盒在BioelectronSeq 4000高通量测序仪采用半导体技术进行检测［11］。测序数据经处理后（去低质量、去重复、GC校正等）获得不低于90M的有效reads数（每个样本不低于3M的uniquereads）。比对到人类基因组参考序列图谱经生物信息学分析分别计算出目标疾病染色体的Z值，男胎根据Y染色体唯一比对条数进行胎儿DNA浓度计算，女胎则基于SeqFF算法建立高维回归模型，使用划分为50kb基因组区域的常染色体序列计数来计算。NIPT检测失败的标准cffDNA浓度＜4%。

1.2.2 介入性产前诊断、孕期超声监测及妊娠结局随访 对选择介入性产前诊断的孕妇，经充分告知和知情同意后，抽取羊水或脐血进行染色体核型分析／染色体微阵列分析（CMA）检测。随访所有入组病例的产前诊断结果、妊娠结局和新生儿情况。我们记录了以下人口统计学特征：年龄、BMI、胎儿数、孕妇的药物使用情况和受孕类型；同时记录了孕中晚期超声检查结果，妊娠或分娩期间的产妇并发症和新生儿情况。所有病例均获得了妊娠结局。

1.3 统计学方法 将研究数据录入Excel表格中进行汇总、整理、统计，应用SPSS22.0软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 基本情况 2017年1月至2022年7月期间选择本院接受NIPT检测孕妇共68581例，其中经两次采血均因浓度低标本39例（0.057%），收集孕妇年龄、BMI、孕妇的药物使用情况和受孕类型、产前诊断情况、孕期超声检查结果、孕期并发症、妊娠结局等资料（表1）。孕妇年龄分布（31.62±5.533）岁，BMI分布（24.51±4.39），其中通过试管婴儿受孕19例（48.72%），双胎妊娠10例（25.64%），预产期高龄妊娠15例（38.46%），唐氏筛查结果异常9例（23.08%）。我们同时记录了第一次和第二次采血孕周和cffDNA浓度（表2），第一次采血孕周（15.95±2.32）周，cffDNA浓度（3.30±0.92）%；第二次采血孕周（18.03±2.48）周，cffDNA浓度（3.42±0.87）%，两次采血间隔时间（14±1.15）d。

表1 39例检测失败病例基本情况

表2 两次采血孕周及cffDNA浓度情况

2.2 产前诊断和孕期超声情况及妊娠结局 孕期超声检查发现异常9例（23.08%）（表1），其中NT增厚合并孕晚期FGR 2例，均接受产前诊断行染色体核型分析和／或CMA检测未检出胎儿染色体异常。孕晚期超声发现单纯FGR 4例，均接受产前诊断，1例染色体核型分析检出46，XN，inv（9）（p12q13）mat，提示胎儿9号染色体臂间到位，评估可能是多态，经验证母系遗传，其余均未见异常。所有病例均进行妊娠结局追踪随访，孕中期发生难免流产2例，早产10例，其余均足月正常分娩，未发现其他异常，所有胎儿均存活。另发现孕期母体并发症10例，包括妊娠期糖尿病8例，妊娠期高血压2例。

2.3 双胎／三胎其中一胎减胎或停育病例NIPT结果、孕期情况、妊娠结局 39例病例中有7例为多胎妊娠早期发生其中一胎停育或选择减胎（表3），NIPT结果两次检测结果均提示男胎，Y染色体z值很低，妊娠结局随访为女性胎儿。造成检测失败原因可能为早期发生停育或减胎的胎儿为男胎，剩余存活胎儿均为女胎，停育男胎持续释放低浓度Y染色体到母血从而引起NIPT检测结果表现为cffDNA浓度低。孕晚期超声2例出现胎儿宫内发育迟缓表现，1例出现羊水过多，1例出现胎儿双侧脑室增宽，其中3例接受产前诊断结果未见异常。6个病例7个胎儿成功分娩，新生儿筛查正常，1例病例发生难免流产。

表3 双胎／三胎其中一胎减胎或停育病例NIPT结果、孕期情况、妊娠结局

3 讨论

随着NIPT技术临床使用越来越成熟，NIPT检测失败病例相关研究日益受到重视，cffDNA浓度低是导致检测失败最常见原因［12］。本研究针对因cffDNA浓度低导致NIPT检测失败的病例展开研究，在我们两次采血NIPT检测失败病例管理方案中，常规提供侵入性产前诊断，但如本研究所示，在临床实践中，只有少数孕妇33.33%（13／39）接受了这一方案，13例均未检出胎儿染色体异常。孕中晚期超声发现胎儿发育异常9例（23.08%），胎儿宫内发育迟缓6例（15.38%），羊水量异常2例（5.13%），胎儿双侧脑室增宽1例（2.56%），没有检出结构畸形病例，所有病例均接受了产前诊断但未检出胎儿染色体异常。表明检测失败病例孕期超声出现胎儿发育异常孕妇更容易接受侵入产前诊断，孤立的超声软指标异常的胎儿与遗传异常的发生率没有增加。

在我国2016年发布的NIPT技术规范中双胎人群属于慎用人群，表明在给予详细的遗传咨询后可以进行NIPT检测，但是当时NIPT对于双胎检测效能和失败概率还缺乏大数据文章报道。近年来双胎NIPT检测研究越来越多，证实双胎检测效能与单胎基本相近，但是检测失败率较单胎高［13］。本研究中检测失败样本中涉及双胎病例有16例（41.03%），其中包括孕早期双胎／三胎之一停育／减胎7例（17.95%）（表3），双胎妊娠两个胎儿性别不一致9例（23.08%）。与Darine报道一致［14］，该研究也提出双胎性别不一致增加检测失败风险。结合文献数据及本研究结果标明双胎人群是NIPT检测失败的“高危”人群，临床医师在检测前咨询过程中也应注意告知相关风险。另外，本研究发现7例孕早期双胎／三胎之一停育／减胎病例，NIPT检测结果提示为男性胎儿，但Y染色体Z值均小于15（表3），妊娠结局随访均为女性胎儿。可能原因为孕早期停育／减胎胎儿为男胎，存活胎儿为女胎，停止发育男性胎儿持续释放较低浓度Y染色体到母血，导致NIPT检测结果为男性胎儿，与最终分娩胎儿性别不一致。Jacintha报道也提出了类似论点［15］，因此对于孕早期双胎／多胎之一停育／减胎病例，在进行NIPT检测前应告知相关风险，增加检测失败概率。另外，本研究中通过辅助生殖技术受孕的病例19例，占比48.72%，以往有研究报道辅助生殖技术受孕孕妇外周血cffDNA浓度较自然受孕情况低［16］，但仍需要更大样本数据来证明。

众所周知，孕妇外周血cffDNA主要来源于凋亡的胎盘滋养层细胞经过胎盘屏障时受母体免疫攻击破裂的胎儿细胞或胎盘细胞凋亡进入母血后自然降解成DNA片段。一些妊娠期的母体及胎儿并发症均可能影响cffDNA浓度，已经证实某些并发症可以使cffDNA浓度升高，比如子痫前期、胎儿生长受限、早产、前置胎盘和妊娠剧吐等。本研究中，有25.64%（10／39）病例发生了早产，但是其中7例是双胎妊娠，不排除是双胎妊娠本身原因引起的早产。根据体重与cffDNA浓度的负相关性推测临床上常伴有肥胖的疾病如激素治疗的自身免疫性疾病和糖尿病也可能会导致cffDNA浓度降低，使NIPT失败的发生率增加。本研究有20.51%（8／39）孕晚期出现妊娠期糖尿病和5.13%（2／39）出现了妊娠期高血压等并发症。但是妊娠期糖尿病和高血压是否与cffDNA浓度相关联，目前的研究结果尚未证实这一观点。Maeve等研究发现，糖尿病合并妊娠孕妇的cff DNA浓度与正常孕妇差异无统计学意义［17］。Mary等报道，cffDNA浓度低可能有更高的不良产科和围产期结局风险，临床医生应该意识到妊娠并发症的风险增加［18］。因此，对于因cffDNA浓度低NIPT检测失败孕妇，在给予详细的遗传咨询及产前诊断同时应建议定期超声监测胎儿生长发育及监测母体并发症，避免发生不良妊娠结局。

本研究局限性，首先虽然纳入总样本量68581例病例，但是经两次采血均因浓度低标本只有39例（0.057%），可能不够全面，未检出遗传异常病例。其次对于检测失败病例孕期用药情况收集不足，只收集到1个病例孕妇早期使用肝素。Joshua等报道证实了母体孕期使用肝素和低剂量阿司匹林增加与cffDNA浓度低风险［19］。但是Yohann报道孕期使用肝素与cffDNA浓度低没有明显相关性［20］。

总之，对于NIPT检测失败的病例，应明确原因，孕期出现母体并发症和不良妊娠结局风险增加，应建议接受进一步的遗传咨询、产前诊断和定期超声监测胎儿生长发育和母体并发症。