75例骨骼发育异常胎儿与遗传因素的相关性分析

黄如纯 柯华玲 皮回春* 刘维强 吴丽萍 吴思琪 刘金星

（1.深圳市龙岗区妇幼保健院／汕头大学医学院龙岗妇幼临床学院医学遗传与产前诊断科；2.深圳市龙岗区妇幼保健院／汕头大学医学院龙岗妇幼临床学院超声影像科；3.深圳市龙岗区妇幼保健院／汕头大学医学院龙岗妇幼临床学院中心实验室，广东深圳518172）

胎儿骨骼发育异常（skeletal dysplasia，SD）是一组影响骨和软骨生长发育的疾病，包括骨形状、大小、密度的异常［1］，是较为常见的出生缺陷，在胎儿结构畸形中占10%，其在活产儿中的发病率约为0.36／10000～3.2／10000［2-4］。过去人们认为，骨骼发育异常仅仅与环境致畸因素暴露、药物、母体自身免疫性疾病等［1］有关，近年来，随着细胞和分子遗传技术的发展，人们逐渐认识到遗传因素在骨骼发育异常胎儿中起着重要的作用，遗传学诊断也成为胎儿产前诊断的主要手段［5］。遗传因素主要包括染色体非整倍体、染色体微缺失／微重复和基因突变等。本研究系统回顾了75例产前超声诊断的骨骼发育异常胎儿的遗传学检测结果，探讨遗传因素在骨骼发育异常胎儿中的作用，为临床遗传咨询提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年1月1日至2022年12月30日在深圳市龙岗区妇幼保健院产前超声发现骨骼发育异常至医学遗传与产前诊断科行遗传学检测的75例胎儿为研究对象，62例局部畸形（包括马蹄内翻足、并指／趾、叠指、上／下肢体骨部分缺如、钩状手等），9例短肢畸形（股骨、肱骨小于2个标准差），4例骨形态学异常（长骨弯曲、胸廓发育不良、骨密度改变等），其中47例行介入性产前诊断进行染色体核型分析、染色体微阵列分析（chromosome microarray analysis，CMA），部分羊水核型分析及CMA检测阴性者进一步行全外显子测序（whole exome sequencing，WES），28例超声诊断骨骼发育异常后孕妇要求直接终止妊娠，经同意后取引产胎儿组织进行CMA检测，部分结果阴性者与其签订《科研检测知情同意书》后，进一步行WES，回顾性分析以上病例的遗传学检测结果。本研究已通过医院伦理委员会的批准（审批号：LGFYYXLLL-2020-002），所有孕妇均接受检测前咨询并签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 超声检查 使用Voluson E8彩色多普勒超声诊断仪，探头频率4.0～5.0MHz。检查医生均经过系统培训，按照统一标准进行早孕期NT、中孕期II级及III级超声检查，全面观察胎儿各系统结构发育情况，参照李胜利等［6］《胎儿畸形产前超声诊断学》诊断胎儿常见的骨骼发育异常。

1.2.2 分组 根据骨骼发育异常的复杂程度及是否合并其他系统异常进行分组，A组为单纯性骨骼发育异常，即胎儿只存在与骨骼发育相关的超声异常；B组为骨骼发育异常合并其他系统超声异常。

1.2.3 羊水细胞培养和染色体核型分析 按照G显带染色体核型分析技术的标准操作对48例胎儿羊水进行细胞培养、收获、制片及G显带染色体核型分析，每例标本使用Leica SL120全自动核型扫描仪扫描100个分裂相。核型诊断标准依据2016年人类细胞遗传学国际命名体系（ISCN2016）。

1.2.4 DNA提取和染色体微阵列检测（CMA）染色体核型结果正常的羊水标本及27例引产胎儿组织，提取DNA后，采用Agilent公司生产的8×60k芯片或美国Affymetrix公司CytoScanTMHD芯片进行全基因组扫描，数据分析参照OMIM、UCSC、ISCA、DGV、DECIPHER等数据库。

1.2.5 DNA提取及全外显子测序（WES） 染色体微阵列分析阴性的4例羊水标本和5例引产胎儿组织提取基因组DNA，进行文库构建，按流程获得最终的测序文库。文库QC检测合格后即上机测序（Illumina NovaSeq 6000测序系统），测得的数据使用配套的科诺安数据分析软件（杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司）进行分析。对发现的变异采用Sanger测序进行位点验证及家系验证。

1.3 统计学方法 采用SPSS 27.0软件进行统计分析，定性资料用率（%）表示，组间比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 染色体核型分析及微阵列分析结果 47例进行了羊膜腔穿刺术的SD胎儿，染色体核型分析检出4例非整倍体：包括3例18三体、1例45，X／del（X）嵌合。发现1例染色体多态，未列入阳性病例统计。CMA额外检出6例致病性拷贝数变异（copy number variations，CNVs）。28例AD胎儿引产后行CMA检测，检出8例非整倍体：包括8例18三体，1例13三体。非整倍体总检出率为：16%（12／75）；CMA额外检出6例致病性CNVs（8%，6／75），综上总检出率为24%（18／75）（图1）。

图1 75例骨骼发育异常胎儿遗传学检测结果

2.2 全外显子测序（WES） 9例染色体正常胎儿进行了WES检测，3例检出致病突变，2例检出疑似致病突变，2例为临床意义不明的突变（VOUS），2例阴性结果；将检出的VOUS也纳入阳性病例统计，检出率77.8%（7／9）（图2）。

图2 SD致病性CNVs Xp22.33微缺失的染色体微阵列分析结果

2.3 统计学分析 75例AD胎儿中A组47例（62.7%，47／75），B组28例（37.3%，28／75），遗传学检测阳性病例共25例（表1），阳性检出率为32.9%（25／75），其中A组、B组阳性检出率分别为21.3%（10／47）、53.6%（15／28），2组间检出率比较差异有统计学意义（χ2＝6.846，P＝0.009＜0.01）（表2）。

表1 不同骨骼发育异常胎儿与染色体、基因异常的关系

表2 A组、B组骨骼发育异常胎儿遗传学阳性检出情况（例）

3 讨论

骨骼发育异常与染色体病相关，从以往研究结果显示，产前超声筛查骨骼畸形的染色体核型检出率为4.65%～6%［7-8］，而染色体微阵列技术将SD胎儿基因组致病性CNVs的检出率比传统染色体核型分析提高了9%～21.95%，并识别和鉴定了一些可能导致胎儿骨骼发育异常表型的候选基因［8-10］。本研究中共检测出12例非整倍体，10例18三体，1例13三体，1例mos 45，X／del（X），染色体非整倍体检出率16%（12／75），比既往报道检出率高，可能与18三体及13三体除骨骼发育异常外往往合并其他结构畸形，在早孕期11～13＋6周NT超声检查及孕中期16～18周II级产前超声筛查可以发现与之相关的表型有关。CMA额外检出8%（6／75）致病性CNV，略低于既往报道，可能与产前胎儿行CMA分析检测的表型谱相对比较狭窄和局限，超声对某些骨骼异常的诊断存在偏差，且本研究样本量较小等因素有关。

不同骨骼发育异常与不同染色体病相关，18三体胎儿会出现拇指短小、并指（趾）、马蹄内翻足、摇椅足、桡骨缺如；13三体胎儿会出现轴后性多指（趾）、手指弯曲伴叠压、马蹄内翻足、小骨盆；Turner综合征产前超声也会有股骨短等表现。本研究中，9例（编号1-9）超声提示钩状手胎儿中有6例18三体，其中4例（编号6-9）合并桡／尺骨缺如；9例（编号10-18）部分骨缺如的胎儿中，仅编号10超声发现桡骨缺如合并小下颌提示18三体；1例重叠指（编号19）合并脊柱发育异常提示18三体；5例（编号20-24）多指／趾畸形，4例单纯多指／趾畸形未发现染色体异常，仅有1例（编号24）合并左心室强光点发现16p13.11微缺失，为致病性CNV；36例（编号25-60）马蹄内翻足病例中，6例合并其他系统异常，检出2例18三体，1例13三体，剩余30例单纯马蹄内翻足，检出3例（编号58-60）致病性CNVs，分别为16p13.11微缺失、16p11.2微缺失、7q11.23微重复。16p13.11微缺失可表现为智力障碍、先天性多发畸形、癫痫等，该缺失区域包含NDE1、MYH11、PDXDC1、ABCC6等13个蛋白编码基因，其中ABCC6是一种ATP依赖性跨膜转运蛋白，主要在肝和肾中表达，其通过调节具有抗矿化活性的基因，调节骨骼系统的钙化过程，参与骨骼发育的发展过程［11］，但目前没有明确的证据证明与马蹄内翻足、多指／趾畸形相关；16p11.2微缺失可导致“16p11.2微缺失综合症”，该区域包含CLN3、TUFM、ATP2A1、CD19等17个蛋白编码基因，症状主要表现为肥胖、轻度发育迟缓和行为问题等；7q11.23微重复可导致“7q11.23重复综合征”，该区域包含ELN、NCF1等27个蛋白编码基因，主要表现为语言延迟、轻微的颅面畸形、认知障碍、先天性心脏病等先天发育异常，但马蹄内翻足在上述综合症中均未见报道，是否与之有关仍待进一步研究。

骨骼发育异常调控基因众多，在2019年修订的遗传性骨骼疾病的病理学及分类中［12］提到遗传性骨病有461种，涉及437个基因。由于SD的遗传异质性，临床表型可从相对轻微到致命性，对于临床表现无特异性的病例，胎儿结构异常的表型可能仅是某些遗传性疾病的一组症状之一，因此通过产前超声明确诊断具有一定的挑战性。近年来，越来越多的研究者报道目标区域外显子捕获检测或全外显子测序，可以提高SD患儿的致病基因检出率［2、13］。本研究中9例（编号62-70）四肢骨短的胎儿，发现3例染色体异常，4例基因突变，阳性检出率为77.8%（7／9），其中1例mos 45，X／del（X），2例Xp22.33微缺失，该区域涉及基因SHOX（图2），该基因的表达仅限于胎儿肾脏、骨骼肌和骨髓成纤维细胞，在骨髓成纤维细胞中的表达最高，为单倍剂量敏感基因，单倍剂量不足可导致身材矮小、手脚短、脊柱侧弯、Leri-Weill软骨发育不良等［14］，相关文献报道［15-16］SHOX基因单倍剂量不足时，胎儿可在孕中、晚期表现出长骨短，与本研究受检胎儿表型相符。另外4例四肢骨短胎儿行WES检测均发现异常，涉及基因有FGFR3、COL2A1、TRIP11，FGFR3基因变异与软骨发育不全有关，其中第8号外显子的c.1138G＞A（Gly380Arg）（编号67）为是FGFR3基因中已知的热点突变，是软骨发育不全患者中最常见的变异位点［17］，编号68胎儿提示FGFR3基因c.2005C＞G（p.Arg669Gly）新发突变，经检索均为目前尚未报道过的致病位点，虽评定为临床意义不明，但该例胎儿超声提示股骨-4SD、肱骨-3SD，股骨长／足长＝0.75（＜0.8），符合软骨发育不全临床表型；编号69提示COL2A1基因c.3472G＞A（p.Gly1158Ser）新发突变，评为疑似致病突变，与软骨生成不全2型有关；编号70提示TRIP11基因c.2632C＞T（p.R878*）纯合突变，与软骨发育不全IA型相关。1例（编号71）超声表现为三叶草型头颅、并指／趾畸形胎儿，发现FGFR2基因c.755C＞G（p.Ser252Trp）新发突变，与Pfeiffer综合征疾病相关；编号72-72均为骨形态学异常胎儿，2例发现SOX9基因，主要与弯肢发育异常相关，其中编号37超声发现胎儿肋骨缩短、胸腔明显狭窄、胸围缩小、四肢长骨明显短小弯曲、马蹄内翻足、小下颌，发现SOX9基因c.1452＿1453del TG（p.Val486Profs*91）经检索为目前尚未报道过的致病位点，丰富了胎儿骨骼异常的基因型与表型的关系。上述WES检测发现基因突变均进行一代验证，除了TRIP11基因为纯合突变外，其余突变均为新发突变，呈常染色体显性遗传，夫妇双方均不携带致病基因，再发的概率较低，但是不能完全排除双亲生殖细胞的嵌合造成再发的可能性。编号70胎儿TRIP11基因突变分别遗传自双亲（图3），呈常染色体隐性遗传，再生育时有25%的概率再发，再次妊娠时可在妊娠早期行绒毛膜穿刺术进行产前诊断，或选择胚胎植入前遗传学诊断避免反复生育畸形胎儿。

图3 1例SD胎儿的WES检测结果（TRIP11基因c.2632C＞T（p.R878*）纯合突变，分别遗传自双亲）

本研究发现，单纯SD和SD合并其他超声异常的胎儿比单纯性SD的胎儿有更高的遗传学阳性检出率。2例SD合并其他超声异常胎儿，在染色体核型、CMA结果未见异常后加做WES的结果仍为阴性，致畸原因不明。可能的原因包括：①WES检测技术无法做到100%覆盖，有可能遗漏致病基因突变［18］；②不排除基因外显子区域以外的DNA序列异常，如非编码区和内含子突变，从而影响了蛋白质的表达，导致疾病发生；③其他因素：环境、药物因素等。对病因未明的骨骼发育异常胎儿我们可进一步增加测序深度或应用全基因组测序进行重测序寻找致病原因。

综上所述，胎儿SD与染色体非整倍体、染色体微缺失微重复综合征及基因突变关系密切，应建议介入性产前诊断，并进行详细的超声检查。本研究为回顾性分析，具有一定的局限性，一是样本量较小，结果可能存在偏倚；二是对胎儿研究不够深入，大部分SD胎儿尤其是SD合并其他超声异常胎儿未进一步行WES检测。进一步的研究应该继续收集更多病例，对染色体阴性结果胎儿进行WES检测，分析其相关性及可行性，从而提供更加精准的产前诊断，为产前遗传咨询、预后判断及再发风险评估提供依据。