抗、感品种棉花根系分泌物对尖孢镰刀菌生长及基因表达的影响

娄慧 朱金成 杨洋 张薇

（石河子大学农学院 新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室，石河子 832003）

棉花（Gossypium spp.）是我国最重要的纤维经济作物之一，同时也是重要的油料作物，2022年全国植棉面积为3 000.3千hm2。新疆是中国最大的棉花生产地区，2022年占全国棉花总种植面积的83.22%（国家统计公报，http://www.stats.gov.cn/sj/zxfb/202302/t20230203_1901689.html）。棉花生产是新疆农业生产的主要产业，随着新疆棉花种植面积的扩大和连作年限的延长，棉花枯萎病的发生日趋加重，已成为影响新疆棉花生产可持续发展的一大难题［1］。

棉花枯萎病是棉花的一种常见土传性的植物真菌病害，病原菌是尖孢镰刀菌萎蔫专化型真菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum, Fov），由于其病原菌顽强、传播迅速，危害极大，一旦发生难以治愈［2］。尖孢镰刀菌通常从棉花的根尖或根部伤口入侵，在入侵棉花的过程中，孢子或微菌核受到棉花根系分泌物的刺激萌发，因此棉花根系分泌物与尖孢镰刀菌致病密切相关［2-3］。Jia等［4］研究发现，连作马铃薯（Solanum tuberosum L.）根系分泌物会促进尖孢镰刀菌菌丝生长和孢子繁殖，同时增强其致病性，导致连作马铃薯枯萎病发生。Yang等［5］通过比较抗、感香蕉（Musa nana Lour.）品种培养液对香蕉枯萎病菌Foc4根系定殖的影响发现，抗、感品种根系分泌物中有机酸组分存在明显差异，分析表明抗病品种具有促进拮抗菌生长，且抑制病原菌定殖的作用。Li等［6］通过对不同抗性西瓜［Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.］品种根系分泌物研究发现，感病品种根系分泌物可促进尖孢镰刀菌菌丝生长、孢子萌发，抗病品种根系分泌物则具有抑制作用。

转录组学是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科，从RNA水平研究基因的表达情况。目前已被应用于尖孢镰刀菌生长发育和致病过程中的基因表达分析［7-8］。Yang等［5］通过对香蕉尖孢镰刀菌（F.oxysporum f.sp.cubense）的转录组分析发现，氨基糖代谢通路对于厚垣孢子的形成具有关键作用。Lu等［9］通过高通量转录组测序分析发现，磷脂酶D信号通路受到抑制，可能会导致黏团专化型尖孢镰刀菌生理1号小种（F.oxysporum f.sp.conglutinans）菌丝生长缓慢、致病力减弱。Sun等［10］研究发现，番茄尖孢镰刀菌（F.oxysporum f.sp.lycopersici）转录因子FolCZF1的转录水平在分生孢子和早期侵染阶段上调表达，进一步通过基因敲除获得的FolCZF1突变体菌株在生长速度、产孢、分生孢子形态以及致病力等方面均表现出缺陷，表明FolCZF1为其生长发育所必需。虽然这些研究在一定程度上揭示了尖孢镰刀菌生长发育及其致病的分子机制，但关于不同棉花品种的根系分泌物对尖孢镰刀菌基因表达的影响仍未见报道。

本研究通过抗、感棉花品种根系分泌物与枯萎病菌的共培养，探究根系分泌物对棉花枯萎病菌生长的影响，同时对差异表达基因（DEGs）进行GO功能注释和KEGG富集分析，从转录水平对其相互作用机制进行探讨，为筛选潜在的关键致病基因及棉花枯萎病的防治奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

棉花感病品种新海14号（XH-14）和抗病品种新海41号（XH-41），枯萎病菌株（F327）均由石河子大学农学院棉花分子育种实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 棉苗的种植 将棉花种子浸泡在75%酒精中消毒10 min，用蒸馏水冲洗3次。将其铺至有3层纱布的发芽盒内生长至脱壳，用海绵包裹棉花根系穿过35孔泡沫板，防止根系受到伤害，然后将泡沫板放于装有5 L霍格兰营养液的塑料盆中，同时使用氧气泵连续通氧。45 d后获得根系分泌物粗收集液，经定容、过滤后调整浓度为0.2 g/mL（指每mL收集液中含0.2 g鲜根重的根系分泌物）。

1.2.2 尖孢镰刀菌样本的制备 采用查氏培养基培养Fov分生孢子，在25℃、220 r/min黑暗条件下培养5 d后，进行过滤，收集新鲜的分生孢子用于根系分泌物的培养。称取0.5 g分生孢子悬浮在10 mL根系分泌物水溶液中，在25℃、220 r/min条件下进行培养，于培养后6、12、24和48 h分别离心收集菌体。液氮速冻后于-80℃冰箱保存，用于转录组测序。选取0 h的Fov样本，标记为F0；感病品种XH-14根系分泌物培养的Fov，分别标记为G6、G12、G24和G48；抗病品种XH-41根系分泌物培养的Fov，分别标记为K6、K12、K24和K48；水培养的Fov，分别标记为W6、W12、W24和W48。共13个样本，每个处理2个生物学重复，共构建26个文库。

1.2.3 根系分泌物对尖孢镰刀菌生长的影响

1.2.3.1 根系分泌物对菌丝生长的影响 将马铃薯培养基倒入玻璃培养皿中，冷却凝固，将2 mL根系分泌物水溶液在培养基表面涂抹均匀。待分泌物浸入培养基表面后，用灭菌的5 mm打孔器在菌落上制作菌饼，接种于培养基中心位置，每皿1个菌饼，每个处理3个重复，以不加根系分泌物的培养基作为对照（CK），每个处理组设置3个重复。倒置于人工气候箱中（温度28℃，相对湿度75%）暗培养3、5、7 d，利用十字划线法测定菌落直径。

1.2.3.2 根系分泌物对孢子萌发的影响 将0.5 mL孢子混悬液与等量根系分泌物水溶液滴于凹玻片，放于恒温箱（28℃）培养2、4、6、8和10 h，并统计孢子萌发数，以无菌水为对照（CK），每个处理组设置3个重复。

1.2.3.3 根系分泌物对菌生物量的影响 将直径5 mm同龄等量的菌饼分别接种于抗、感品种根系分泌物培养基上，每个处理组设置6次重复。将培养皿倒置于恒温箱（28℃）培养3、5、7 d，干重比色法测定菌的生物量。

1.2.4 根系分泌物培养尖孢镰刀菌的转录组分析

1.2.4.1 RNA的提取 采用Tiagen公司RNA simple total RNA提取试剂盒提取Fov中的总RNA。

1.2.4.2 RNA测序文库的创建 测序RNA测序文库的创建和测序工作均由北京百迈客生物科技有限公司完成，使用Illumina HiSeq TM 4000测序仪进行测序。

1.2.4.3 RNA测序数据的分析及差异表达基因的筛选 通过HISAT软件将Clean reads比对Fov的参考基因组（https://fungi.ensembl.org/Fusarium_oxysporum_f_sp_vasinfectum_25433_gca_000260175/Info/Index），统计Reads在参考基因组上的分布和覆盖率，并对其进行FPKM转换，从而获得全部基因的表达水平。再用DEGseq进行差异分析，筛选阈值为qvalue＜0.005且|log2.Fold_change|＞1。然后，对DEGs（上调和下调）进行GO功能富集分析及KEGG代谢通路富集分析。

1.2.4.4 利用RT-qPCR对DEGs进行验证 为验证RNA-seq结果的可靠性，选择12个DEGs进行RT-qPCR验证。通过Primer Premier 5.0设计特异性引物，使用SYBR Green Mix在罗氏LightCycler®480上进行分析，按照2-ΔΔct法计算基因的相对表达量，以Fov微管蛋白基因（β-tubulin-F: 5′-CGTCTAGAGGTACCCATACCGGCA-3′, β-tubulin-R: 5′-GCTCTAGACTGCTTTCTGGCAGACC-3′）为内参基因（表1）。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。实验参数为94℃ 1 min；94℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s；40次循环，设置3次重复。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 数据处理及作图 用Graphpad Prism 8软件对数据进行处理和绘图。

2 结果

2.1 根系分泌物对尖孢镰刀菌生长的影响

通过抗、感品种根系分泌物对尖孢镰刀菌的处理，结果发现，随着萌发时间的延长，XH-41根系分泌物处理组的孢子萌发率显著低于XH-14根系分泌物处理组和CK对照组，其中XH-41处理组在第10小时时孢子萌发率为72.10%，与CK对照组相比显著降低，降低了27.21%（图1-A）。在培养第7天时，XH-14和XH-41根系分泌物处理组菌的生物量分别为101.31和68.51 mg，与CK对照组相比，XH-14根系分泌物处理组提高了10.94%，而XH-41根系分泌物处理组降低了24.98%（图1-B）。XH-14根系分泌物处理组的孢子萌发率，显著高于XH-41根系分泌物组和CK对照组，其中XH-14处理组在10 h时孢子萌发率为98.61%，与CK对照组相比有所增加，提高了0.62%。XH-41根系分泌物处理组抑菌圈显著小于其他两组处理，在7 d时菌落直径为5.4 cm，相比XH-14根系分泌物处理组和CK对照组，分别降低了12.52%和3.41%。而在培养3-7 d的XH-14根系分泌物处理组菌落直径为3.4-6.4 cm，显著大于CK对照组（图1-C, D）。以上结果表明，感病品种XH-14根系分泌物促进尖孢镰刀菌的生长，抗病品种XH-41根系分泌物抑制尖孢镰刀菌的生长。

图1 根系分泌物对尖孢镰刀菌生长的影响Fig.1 Effects of root exudates on the growth of Fusarium oxysporum

2.2 转录组分析

2.2.1 RNA-seq质量评估和转录组模式分析 通过对抗、感棉花根系分泌物培养的尖孢镰刀菌26个样本进行RNA-seq，共获得175.85 Gb Clean data，各样品Clean data均达到5.70 Gb，Q30碱基百分比在91.94%及以上。Clean reads比对到Fov参考基因组上的reads数Mapped reads占86.71%-94.79%（表2和图2）。每个样本的两个生物学重复间FPKM分布的皮尔逊相关系数R2均在0.945-0.987之间（P＜0.001），表明RNA-seq数据可靠，具有较好的重复性。

图2 尖孢镰刀菌样本间相关性分析Fig.2 Correlation analysis among the samples of F.oxysporum

表2 测序数据评估统计表Table 2 Evaluation statistics of sequencing data

2.2.2 尖孢镰刀菌差异表达基因分析 此次分析共检测到表达基因20 419个，已知基因18 905个，新基因1 514个。基于表达量定量结果，进行DEGs筛选（图3）。感病品种XH-14根系分泌物处理组样本与同时间水处理样本（W6、12、24、48 h）相比，培养6、12、24和48 h后分别鉴定到1 583个（744个上调和839个下调）、1 117个（708个上调和409个下调）、1 611个（765个上调和846个下调）和1 715个（945个上调和770个下调）DEGs（图4-A,D）。抗病品种XH-41根系分泌物处理组样本与同时间水处理样本（W6、12、24、48 h）相比，培养6、12、24和48 h后分别鉴定到926个（550个上调和376个下调）、589个（318个上调和271个下调）、1 920个（891个上调和1 029个下调）和1 653个（790个上调和863个下调）差异表达基因（图4-B,D）。（G vs W）vs（K vs W）共获得DEGs数量为4 248个，G vs W的DEGs数量为1 277个，K vs W的DEGs数量为716个，二者共同富集的DEGs数量为2 255个（图4-C）。结果发现，抗、感品种根系分泌物培养的样本均存DEGs，其中在感病品种XH-14根系分泌物培养的样本中上调的DEGs多于抗病品种XH-41根系分泌物培养的样本，与培养24、48 h相比，培养6、12 h的DEGs显著上调。表明Fov对不同抗性品种的根系分泌物均能够产生响应，但对感病品种根系分泌物的响应较为强烈。

图3 尖孢镰刀菌的差异表达基因统计Fig.3 Statistics of differentialy expressed genes of F.oxysporum

图4 尖孢镰刀菌的差异表达基因Fig.4 Differentially expressed genes of F.oxysporum

2.2.3 尖孢镰刀菌的DEGs功能注释 对已注释的DEGs进行GO功能富集和KEGG通路分析，GO功能富集结果显示，感病品种XH-14根系分泌物处理样本中，在生物过程方面，DEGs主要富集在氨基酸转运（amino acid transport, GO:0006865）、跨膜转运（transmembrane transport, GO:0055085）、脂肪酸生物合成过程（fatty acid biosynthetic process,GO:0006633）等条目上；在细胞组分方面，主要富集在膜的组成部分（integral component of membrane,GO:0016021）条目上；在分子功能方面，主要富集在阳离子转运ATP酶活性（cation-transporting ATPase activity, GO:0019829）、转移酶活性、转移酰基（transferase activity, transferring acyl groups,GO:0016746）、离子通道活性（ion channel activity,GO:0005216）等条目上（图5-A）。抗病品种XH-41根系分泌物处理样本中，结果（图5-B）显示，在生物过程方面，DEGs主要富集在跨膜转运（transmembrane transport, GO:0055085）、三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle, GO:0006099）、氨基酸转运（amino acid transport, GO:0006865）过程等条目上；在细胞组分方面，主要富集膜的组成部分（integral component of membrane, GO:0016021）条目上；在分子功能方面，主要富集在阳离子转运ATP酶活性（cation-transporting ATPase activity, GO:0019829）、ATP酶活性（ATPase activity, GO:0016887）、磷酸二酯水解酶活性（phosphoric diester hydrolase activity,GO:0008081）等条目上。

图5 XH-14（A）和XH-41（B）差异表达基因GO功能富集Fig.5 GO functional enrichment of XH-14（A）and XH-41（B）differentially expressed genes

KEGG富集分析结果显示，感病品种XH-14根系分泌物处理样本中，共有988个差异基因注释在125个通路上，富集较为显著的有柠檬酸循环（TCA循环，citrate cycle（TCA cycle）），涉及20个基因；类胡萝卜素生物合成（carotenoid biosynthesis），涉及3个基因；核黄素代谢（riboflavin metabolism），涉及10个基因；谷胱甘肽代谢（glutathione metabolism），涉及21个基因；淀粉和蔗糖代谢（starch and sucrose metabolism）涉及40个基因（图6-A）。抗病品种XH-41根系分泌物处理样本中，共有882个差异基因注释在123个通路上，富集较为显著的有碳代谢（carbon metabolism）、类胡萝卜素生物合成（carotenoid biosynthesis），涉及68个基因；其他聚糖降解（other glycan degradation），涉及11个基因；ABC运输工具（ABC transporters），涉及36个基因；脂肪酸代谢（lipoic acid metabolism），涉及2个基因；角质、木栓素和蜡的生物合成（cutin, suberine and wax biosynthesis），涉及3个基因（图6-B）。

图6 XH-14（A）和XH-41（B）差异表达基因KEGG代谢通路富集Fig.6 Enrichment of KEGG metabolic pathway of XH-14（A）and XH-41（B）differentially expressed gene

2.2.4 细胞壁降解相关基因的分析 Fov从穿透根细胞壁到在宿主植物定殖期间内，会分泌多种细胞壁降解相关的酶，在植物细胞壁的降解和宿主-病原体互作中起重要作用。本研究对抗、感病品种XH-14和XH-41根系分泌物处理样本的基因相对表达水平，进行聚类分析。共有24个DEGs富集到细胞壁降解相关通路，14个水解酶活性，水解O-糖基化合物（hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds, H）、2个α-L-葡糖苷酶活性（alpha-L-fucosidase activity, A）、3个β-半乳糖苷酶（betagalactosidase activity, B）、2个甘露糖寡糖葡萄糖苷酶活性（mannosyl-oligosaccharide glucosidase activity, M）、1个果胶裂解酶活性（pectate lyase activity, PL）、1个聚半乳糖醛酸酶活性（polygalacturonase activity, P）、1个纤维素酶活性（cellulase activity, C）。其中“水解酶活性、水解O-糖基化合物”基因富集最多，与K6、12、24、48 h处理相比，在G6、12、24、48 h处理下显著上调，其中G6 h处理上调基因数目达到10个（图7）。结果表明，在感病品种XH-14根系分泌物处理下，尖孢镰刀菌中存在更多与细胞壁降解相关的基因，参与到Fov致病的相关代谢通路中使棉花感病。

图7 细胞壁降解酶相关基因的聚类分析Fig.7 Cluster analysis of genes related to cell wall degrading enzymes

2.2.5 尖孢镰刀菌的RNA-seq数据验证 随机选取12个DEGs进行RT-qPCR验证，结果发现DEGs的表达趋势与RNA-seq结果相一致，表明RNA-seq数据可信度高（图8）。

图8 尖孢镰刀菌的差异表达基因的RT-qPCR验证Fig.8 Validation of differentially expressed genes in F.oxysporum by RT-qPCR

3 讨论

3.1 根系分泌物对尖孢镰刀菌生长的影响

根系分泌物是植物与土壤及土传病菌相互作用的桥梁，不仅可以通过改变土壤环境间接抑制土传病菌，还可以通过自身作用直接抑制土传病菌［11-13］。众多学者对植物根系分泌物进行了研究，Liang等［14］研究结果表明，西瓜枯萎病菌在不同抗性水稻（Oryza sativa L.）品种的根系分泌物处理下会产生不同的响应，其中ELIO和4007品种的根系分泌物会抑制枯萎病菌孢子的萌发和菌的生长，显著减少了西瓜枯萎病的发生。Chen等［15］研究发现，因抗病黄瓜（Cucumis sativus L.）品种的根系分泌物中含糖类物质较少，对尖孢镰刀菌产生抑制作用；感病、中抗品种的根系分泌物中含糖类物质较多，能够促进病原菌的生长。Lyu等［16］研究发现，抗病品种的根系分泌物抑制枯萎病菌丝生长、孢子萌发和产孢，未接菌与对照相比，提高抑制率，并在接菌后抑制作用增强；感病品种的根系分泌物则表现出促进作用。这与本研究结果一致，抗病品种XH-41的根系分泌物对棉花枯萎病病原菌生长发育具有一定的抑制作用，XH-41根系分泌物处理的菌落直径明显小于CK和感病品种XH-14根系分泌物处理的菌落直径，并且其孢子萌发率和菌生物量均较低。由此推测抗病品种根系分泌物中可能存在某些物质，对尖孢镰刀菌的生长起到抑制作用，而具体分子机制有待进一步地探究。

3.2 尖孢镰刀菌与根系分泌物共培养的转录组分析

Fov能够在土壤和死亡的植物残体中存活多年，防治困难，引发的病害已成为农业上限制作物生产力的重要因素之一，目前人们对于其致病分子机制的了解还很有限［17-18］。Formela-Luboińska等［19］通过探究根腐病致病菌尖孢镰刀菌PkF01孢子萌发的分子机制，对萌发孢子进行RNA-seq，在GO功能富集和KEGG通路分析中发现，与核糖体相关的DEGs显著富集。Li等［20］为了揭示岷江百合（Lilium brownii var.viridulum Baker）抗枯萎病菌防卫反应的分子机制，从岷江百合转录组数据中挖掘了一个响应尖孢镰刀菌侵染的病程相关蛋白（PR）4基因，通过RT-PCR和染色体步移扩增得到LrPR4的DNA序列及其启动子片段，并初步分析其功能。徐丽娇等［21］研究发现在干旱条件下，丛枝菌根真菌（AMF）的根外菌丝跨膜形成了H+外流和Ca2+内流，加快了菌丝和环境两者间的物质交换，促进了AMF与寄主植物间的信号传导，提高了作物对干旱的抵抗能力。本研究利用RNA-seq技术，对抗性不同棉花品种根系分泌物共培养的Fov转录组进行分析，在GO富集分析中发现，跨膜转运（transmembrane transport,GO:0055085）条目在抗、感根系分泌物处理下均显著富集，表明此条目中的基因可能与Fov和棉花间的互作密切相关，为后期筛选枯萎病菌致病相关基因奠定基础。

3.3 尖孢镰刀菌的细胞壁降解酶相关基因分析

在宿主植物的病原菌侵染过程中，病原菌可通过分泌多种细胞壁降解酶来突破宿主植物的细胞壁，然后侵染植物使其感病［22-23］。研究发现，镰刀菌（Fusarium sp.）分泌的细胞壁降解酶主要有果胶酶、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶和磷脂酶等［24-26］。Tini等［27］研究表明利用不同种类镰刀菌侵染小麦，从而引发小麦赤霉病，发现禾谷镰刀菌（F.graminearum）强致病力菌株（FH1和FH8）产生的细胞壁降解酶活性水平显著强于弱致病力菌株（FH11和FH19）。Escobar等［28］通过转录组测序发现，番茄枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.lycopersici）的木聚糖酶基因xyl5和xyl2的表达受时期的影响，xyl5只在侵染前期响应，xyl2在侵染末期响应，xyl3和xyl4在整个过程中均有响应。Wang等［29］研究发现，β-1,4-内切木聚糖酶基因在感病棉花品种根系分泌物处理的大丽轮枝菌（Verticillium dahlia）中显著上调，而在耐病品种根系分泌物和水处理的样品中无明显上调，表明感病棉花品种根系分泌物与黄萎病的发病相关。本研究结果表明，感病品种XH-14根系分泌物培养的Fov样本中特有的上调的DEGs多于抗病品种培养的样本，通过GO功能富集和KEGG通路分析，筛选到XH-14根系分泌物处理下与“水解酶活性、水解O-糖基化合物”（hydrolase activity,hydrolyzing O-glycosyl compounds）相关的基因，这一结果部分解释了Fov容易导致感病品种感染枯萎病的原因，为探讨和解析Fov与棉花相互作用的分子机理及Fov致病的分子机理奠定了基础，对棉花枯萎病的防治具有指导性价值。

4 结论

抗病品种棉花根系分泌物抑制尖孢镰刀菌的生长，感病品种棉花根系分泌物促进尖孢镰刀菌的生长。显著富集到细胞壁降解酶“水解酶活性、水解O-糖基化合物”GO条目。为筛选该病原真菌潜在的关键致病基因奠定基础，为棉花枯萎病的防控提供理论依据。