微生物单细胞分离方法研究进展

张坤 闫畅 田新朋

（1.中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室 中国科学院海洋微生物研究中心 中国科学院南海海洋研究所，广州 510301；2.南方海洋科学与工程广东省实验室（广州），广州 511458；3.中国科学院大学，北京 100049）

细胞是所有生物的基本组成部分和进化的基本单位，研究单细胞对各个关键领域都具有重要意义［1］。随着单细胞分离技术的产生与发展，单细胞分析受到了科学界的广泛关注，单细胞分离技术的产生和相关分析对生命科学和生物医学研究产生了越来越大的影响，已被应用到蛋白质、神经肽、酶活性、核酸等多种物质的分析研究中，单细胞方法对于我们理解细胞生物化学和行为之间的联系以及群体水平现象的细胞基础也是必不可少的，这为进一步发展疾病的早期分子诊断奠定分子生物学基础［2-4］。在微生物研究领域，单细胞分离技术为未培养微生物的分离研究提供了新的思路，它在研究微生物生理、基因表达和功能方面也起着重要作用，其最重要的特点是分离并收集目标单细胞的同时可以结合单细胞基因组学进行系统深入的多学科分析研究，因此，可能成为未来绕过微生物培养来揭示微生物暗物质的有力工具［5-6］。

微生物在自然环境中普遍存在，且几乎与所有多细胞生命形式相关，包括植物、动物和人类［7］。自然界中大多数微生物处于未培养状态，被称为 “微生物暗物质”，根据目前所描述的细菌种类和全球细菌多样性指数的系统比较表明，99%细菌仍然未获得纯培养［8］。然而，这些未经培养的微生物在碳氮循环、新型天然产物发现以及维持环境平衡方面发挥着前所未有的作用［9］。近年来，随着扩增子测序、宏基因组学和宏转录组学等非培养方法的发展，全球微生物多样性和分布的信息呈指数增长。基于16S rRNA序列的方法和环境宏基因组学［10］，许多新的候选分类单元得到认可，但目前仍然有很多细菌门级类群尚未获得纯培养［11］。尽管宏基因组学和基因组学数据分析日益增多，但获取未培养微生物的纯培养菌株对于深入系统研究微生物的生理机制、生态作用及遗传进化等仍至关重要。未培养并不意味着永远不能培养，而是意味着我们缺乏关于它们生物学的关键信息，这既是挑战，也是机遇。当前正在聚焦自然环境中微生物的生理状态的研究，这可能为微生物的培养提供全新的思路、方法和途径，即革新尚未培养的微生物的培养策略［12］。为了攻克微生物的不可培养特性，许多研究已开始开发替代培养方法。例如通过向培养基中添加特定的有机或无机化合物来改善生长条件，延长培养时间，降低营养浓度和使用替代凝胶剂等方法，从而成功实现之前未培养微生物在实验室的培养。这些传统的分离培养技术虽然很重要，但对于许多未培养微生物的分离培养来说却略显盲目和偶然，因此需要创新和发展单细胞分离的新技术，新方法并应用到微生物的分离与培养。

目前，新兴培养技术大多遵循两种分离策略，一种是利用高通量方法扩大细胞分离的数量实现增大获取目标物种的机会，例如基于膜扩散的培养方法、基于微流控技术的培养方法等。另一种策略则是靶向分离具有特定功能特征或属于特定类群的微生物，例如基于活细胞荧光标记和分选（Live-FISH）技术的细胞分选以及基于反向基因组学的荧光激活细胞分选等方法［13-15］。第一种策略通过建立大量单细胞培养物，然后筛选并鉴定培养物中的大部分物种来实现未培养微生物的规模化培养，但该策略选择性低，对于目标菌种的获取具有很大局限性。第二种策略对目标微生物具有靶向性，可以选择性分离环境微生物，但在大规模高通量分选方面有局限性。方法各有利弊，但是，通过利用这些培养方法对实现更多未培养微生物的纯培养分离具有重要意义。本论文主要综述了微生物单细胞分离方法研究方面的进展，同时对单细胞分离方法在未来微生物分离培养方面的应用进行展望。

1 微生物单细胞分离方法

自19世纪，琼脂培养基发明以来，微生物分离培养发生了革命性的变化［16］，大量的微生物在实验室条件下获得了纯培养。在微生物学发展的这100多年里，人们尝试了各种方法分离获得未培养微生物，从早期单纯的琼脂平板分离培养方法［17］到后期发展出多种多样固体培养法等；随着生物科技的发展，传统的平板分离方法越来越不能满足人们获得未培养微生物的需求，各种新型单细胞分离方法次序产生，如膜扩散培养法［18］、微流控分选［19］、光镊技术［20］、显微操作技术［21］、拉曼光谱分选［22］、荧光激活细胞分选［23］等方法（图1），对未知微生物研究的方法不断更新，以期攻克99%未知微生物纯培养的问题。尽管目前的单细胞分离方法仍存在一些限制，但是运用这些方法使我们获得了许多未培养的新微生物资源，让我们更好地了解到这些微生物的生理及生态作用，显示出单细胞分离技术对未培养微生物研究明显的优势。本文简要介绍几种常用的单细胞分离方法及其在微生物研究中的应用。

图1 单细胞分离方法Fig.1 Single cell separation methods

1.1 膜扩散培养法

由于来自环境样本的微生物很少能在培养皿中的营养培养基上生长，造成了大量未培养微生物难以发掘和利用，因此，研究者计划通过模拟自然环境条件来实现未培养微生物的纯培养。2002年，Kaeberlein等［18］根据“提供其自然环境的化学成分可以将其中不可培养微生物实现其可培养”的假设设计了一个扩散室（diffusion chamber），来模拟这些微生物自然环境，并让其能够充分接触到自然环境中的生长成分。环境中的营养物质和代谢产物可透过通透膜扩散到培养基中，但膜内外的微生物不能相互接触，从而可使膜内微生物获得其原始生境中所需的所有生长因子，保证了细胞间的物质交流以促进未经培养的微生物在模拟的自然环境中生长。通过孵育培养获得了35%以上未知的、全新的微生物，为环境中未培养微生物的可培养提供了新的技术。根据同样的假设，Aoi等［29］研制了一种用于环境微生物原位培养的中空纤维膜室（HFMC），该系统由48-96块多孔中空纤维膜与注射器连接而成。通过连续稀释环境中的细胞获得极限稀释的细胞悬浮液，将每个纤维膜室接种上单个细胞，然后浸入为细胞提供生长因子的环境水样中，因此，各种类型的纯培养细胞可以在模拟环境条件下在每个室中生长［13］。另外，Nichols等［30］设计并测试了一种隔离芯片（ichip），它由几百个微型扩散室组成，每个扩散室都接种一个环境细胞。通过ichip的应用微生物可恢复超过标准培养的许多倍，并且生长的物种具有显著的系统发育新颖性。这种新方法可以接触到大量多样的以前无法接触到的微生物，非常适合基础研究和应用研究。

1.2 显微操作技术

从环境样本中捕获和分离单细胞的显微操作技术在40多年前就被引入，之后人们曾多次尝试使用显微操作技术来改善对单细胞的处理。利用视觉反馈系统，显微镜聚焦到目标物上，将调节浓度的微生物悬浮液吸入简单的毛细管中，使单个细胞在确定的体积内进行转移［21,28］。早期系统的主要障碍是放大率低导致无法操作单个原核细胞，但随着显微镜的不断改进和微毛细血管的发展，显微操作技术已经成功地将单细胞从实验室培养和自然环境中分离出来。显微操作技术是一种简单、方便、高效和成本低的分离单个细胞的方法，但是其吞吐量有限、自动化程度低、操作技术要求较高［31-32］。2005年，Ishøy等［33］提出了一个改进的系统，该系统由倒置显微镜、微进样器和微操作器组成，可以使单个活的原核细胞从混合细胞中分离出来且不受其他非目标细胞的污染。他们利用微毛细管将分离的细胞捕获并转移到合适的生长培养基中，并证明了被显微操作器捕获的细胞确实可以生长。然而，目前显微操作的主要局限性仍然是在培养基中单细胞生长的成活率较低，这阻碍了该技术在实验室的广泛应用［34］。

1.3 光镊技术

1986年，Ashkin等［20］发明了光镊，并用光镊对病毒和细菌进行了捕获和操作实验，由此开启了光镊在物理学和生物学中的广泛应用。光镊的原理是使用高度聚焦的激光束来捕捉和操纵微观的中性物体，它能够对微米大小的介质物体施加作用力，如小的电介质球形粒子，它们受到两种力的作用，即光子沿其传播方向撞击细胞所产生的散射力和场强梯度所产生的梯度力［35-36］。在光镊技术操作中不需要物理接触，细胞可以在无菌条件下的封闭室中完成操作［37］。2019年，Zhang等［38］确立了一个操作程序，允许使用光镊处理和成像单个大肠杆菌细胞，同时最大限度地减少对细胞生长和蛋白质合成的负面影响，这是一种使用光镊长期稳定处理单个大肠杆菌细胞的方法，这项工作为光镊在微生物学中的应用铺平了道路。结合微流控技术，光镊为在单个微芯片平台下对不同细胞类型进行高通量分选提供了光学技术的发展前景。在单细胞生物化学研究中，将光镊与拉曼光谱相结合也变得越来越流行，因为利用光的力量来固定所研究的细胞，不仅避免了将细胞固定在基质上的负面影响，而且还提高了记录光谱的质量［39］。Liu等［40］描述了一种结合光镊拉曼光谱、渐进式增长生成对抗网络（PGGAN）和残差网络（ResNet）分析的微生物分类新方法，利用该方法对深海细菌进行了单细胞拉曼光谱分析。PGGAN可以为大多数现有的深度学习方法快速生成大量的高分辨率拉曼光谱，并提高其预测精度，ResNet能够对低信噪比的拉曼光谱进行准确的分类。结合PGGAN的高分辨率数据，ResNet可以快速、高效、准确地对单细胞拉曼光谱进行分类，这在海洋生物学与生态学中具有重要意义。因此，光镊技术与其他技术联用既发挥了其优点也弥补了不足，有利于促进未来单细胞分离方法的发展。

1.4 微流控技术

高效的细胞分离是生物和医学研究中的必要手段，由于传统技术的分离和分析稀有细胞方面的能力有限，如选择性普遍较低、样品损失较大等，限制了该方法的应用，因此，最近发展了许多微尺度分离技术［41］。微流控芯片技术是一种能够在微尺度上运输和操纵流体和颗粒（如细胞）的技术，已被用于稀有细胞的分离、富集和分析［19］，具有更高的效率和灵敏度水平。微流控技术利用不同细胞群内在特性的差异来实现分离，特别是细胞的机械和物理性能，包括尺寸、形状、密度、附着力和可变形性，都是特性区分的常见标志［41］。微流控设备可以通过微滴流体技术［42］、介质电泳［43］、声学［44］、磁学［45］等方法对细胞进行分类。微液滴产生的常见几何结构包括T型结、流聚焦和共流结构，基本工作原理是相同的，即在两种共流非混相流体之间创建一个界面，其中一种流体自我分离成离散的液滴，液滴被另一种流体包围［42］。介质电泳（DEP）是可极化粒子在非均匀电场中的诱导运动，已被证明是在微流体系统中传输、积累、分离和表征微/纳米级生物粒子的完美候选方法［43］。声学分离技术主要是基于体声波或表面声波来精确控制细胞或者粒子的分离［44］。磁分选通过使用抗体、多肽或凝集素使磁珠表面功能化，磁珠可以高选择性地附着在细胞上或被细胞吞噬，从而使利用外部磁场操纵细胞成为可能［45］。微流控芯片在提高分析灵敏度、准确性和吞吐量等方面具有突出的优点。它的某些特性，如快速样品处理和测定中流体的精确控制，使其成为有吸引力的替代传统实验方法的候选技术。在过去的20年里，发展微流控技术，即所谓的“芯片上的实验室”，已成为一种趋势，以使这些程序小型化和自动化，用于分离细胞和微粒的过程被缩小成一个小的微流控芯片［46］。近年来，微流控土壤芯片（microfluidic soil chip）被开发出来，用于观察土壤过程和微生物间的相互作用。这种技术可以使可见光谱进入自然不透明的土壤系统，并能够直接研究微观结构和化学控制环境中的微生物生长和相互作用［47-48］。Qiao等［49］开发了一种微流控荧光激活液滴分选技术来筛选PET塑料降解菌，并评估了假定的PET酶的降解活性，该技术可以广泛应用于PET降解微生物和酶的发现。微流控技术是一种强大的平台技术，它不仅被应用在微生物的检测，还能够实现罕见的细胞分离、高效的单细胞组学分析，为药物开发提供了平台［50］。2021年，Xu等［51］引入了一种基于离心机的微流控浓缩器，用于毫升到皮升的细菌悬液浓缩，以实现快速和实时的病原体检测和药敏实验。该方法可以通过显微镜直接观察病原菌细胞，更重要的是，药敏实验可以从原始样品开始而无需传统的预培养步骤，其富集效率更高。可见微流控技术大大提高了单细胞分选及药物开发的效率，具有良好的发展前景。

1.5 单细胞拉曼分选

单细胞拉曼光谱（SCRS）作为一种振动光谱，是拉曼激活细胞分选技术（RACS）的基础。通过激光与样品相互作用时产生的化学键的振动和旋转，来识别分子的特殊指纹，然后与共聚焦显微镜或其他设备结合，实现单细胞检测。在单细胞拉曼光谱的基础上，拉曼激活细胞分选技术提供一种无标记的细胞分选方法，拉曼激活细胞分选系统将单细胞拉曼光谱检测仪器耦合到可在溶液中工作的细胞分离系统上，从而实现单细胞的分选。此外，拉曼激活细胞分选技术与具有独特指纹特征的单细胞拉曼光谱的结合，有效地测量单个细胞中所有拉曼活性成分的生化谱，实现了对细胞功能的定量和多方面研究［22,52］。拉曼激活细胞分选是多种单细胞分类技术中的一种新兴方法，包括4个基本操作程序：首先，在检测点定位样品；其次，从细胞中获取拉曼信号；第三，快速的现场分析和实时决策；最后，收集目标样品的分离物［53］。Wang等［54］利用拉曼激活细胞分选技术分选人肠道中的耐药菌，其研究结果表明，人类肠道耐药菌群和个人病史之间有很强的关系。Zhang等［25］开发了一种静态版本的RACS系统，被称为拉曼活化细胞弹射（RACE）系统，该系统通过应用脉冲激光将选定的细胞从衬底喷射到制备的容器中，使其分布在CaF2载玻片上（涂有光吸附中间层），利用该系统对类胡萝卜素生产酵母（9%）和非类胡萝卜素生产酿酒酵母（91%）的两种细胞株的混合物进行了分选，前者平均富集到73%，并显示了亚秒级快速拉曼激活的细胞分选效率。Su等［55］对RACE系统进行了优化，不仅提高了土壤微生物群拉曼活化细胞弹射和测序（RACE-Seq）的成功率，而且将精确保护细胞免受激光辐照作为方法开发的优先任务。目前，单细胞拉曼分选仍在不断改进及发展，在未来可能应用到多个研究领域。

1.6 荧光激活细胞分选

荧光激活细胞分选（FACS）由于其成熟的技术发展、高灵敏度和高通量特点，已成为许多生物学家选择的细胞分选方法［41］。FACS是一种具有单细胞分选能力的流式细胞仪，是基于大小、粒度和荧光来描述和定义异质细胞群中不同细胞类型的细胞分选技术［32］。FACS是唯一可用的基于内染色或细胞内蛋白表达（如基因修饰的荧光蛋白标记）分离细胞的技术，它可以根据大小、粒度和荧光对单个细胞进行纯化。为了分离纯化目标细胞，首先用荧光标记的单克隆抗体（mAb）对其进行染色，该抗体可以识别所需细胞群上的特定表面标记，未染色的细胞作为阴性对照［23］。FACS纯化需要一个具有分选能力的流式细胞仪和相应的软件。利用流式细胞仪细胞分选过程中，大量悬浮细胞以液滴流的形式在激光前传递，每个液滴包含一个单细胞，荧光检测系统根据预先确定的细胞荧光参数检测目标细胞。该仪器将电荷应用于包含目标细胞的液滴上，静电偏转系统有助于将带电液滴收集到适当的收集管中［56］。最新的技术简化了处理流程，提高了细胞分选能力，并引入了多参数测量。现在可以用2-3种不同的荧光染料来研究微生物群落，这些染料针对不同特定的生物分子和生理过程，因此，这样可以同时评估细胞的生理状态、它们的分类地位和功能基因表达情况，并最终将靶细胞分离和应用于进一步的研究［57］。Espina在荧光激活细胞分选技术的基础上开发了一种单一程序，帮助区分基于活力染色结合流式细胞术和荧光激活细胞分选的不可培养现象。利用该技术在选定的土壤样品中，通过选择具有活性和代谢活性的细菌，培养细菌的成功率提高了一倍［58］。Ozawa等［59］利用荧光激活细胞分选从水样中专门检测和分离单个大肠杆菌O157:H7细胞，结果表明利用基于流式细胞仪的荧光激活细胞分选技术进行单细胞分离是获取致病菌的有效工具。荧光激活细胞分选技术的应用十分广泛，在单细胞分选过程中也可以联合其他技术来达到单细胞分选的目的。

2 单细胞技术在微生物靶向分离中的应用

虽然目前单细胞分离技术有很多种，但是微生物单细胞靶向或者特异性分离技术却很少。然而许多研究过程中往往需要获得样品中特定类群的纯培养物，因此就需要实现微生物的靶向分离和培养。本文介绍几种目前主要的单细胞技术在微生物靶向分离中的应用。

2.1 基于荧光原位杂交技术的单细胞分离方法

荧光原位杂交（FISH）是一种强大的可视化群落环境中微生物种群的方法，可以此为基础，通过荧光激活细胞分选（FACS）将目标种群从多物种背景中分离出来［60］。2020年，Yilmaz等［61］修改了标准的核糖体RNA靶向荧光原位杂交（FISH）方案，该方案删除了FISH中细胞固定步骤，可允许恢复未修饰的核酸。利用该方法，不仅成功标记而且在荧光显微镜中观察到了生物反应器污泥和白蚁后肠样品中的杂交细胞。然后，他们用群体特异性寡核苷酸探针（使用溶液中无固定FISH）标记污泥样本中的一种细菌和一种古菌种群，并使用FACS对杂交种群进行分类。基于16S rRNA基因测序，他们证明了分类的群体对目标生物高度富集，从而使用改进的FISH方案确认探针特异性。这种方法有助于后续的基因组测序和目标菌种的分析。最近Batani等提出一种Live-FISH新方法（图2）［14］，证明了无固定化的细菌可以在荧光原位杂交过程中存活，并且通过优化离心速度和重悬缓冲液等因素可以提高细胞存活率。接下来，他们证明了标记的DNA探针可以被引入活的细菌细胞，并提供了与16S rRNA靶向发生特异性杂交的证据。Live-FISH标记包括4个步骤，第一步是预杂交，即样品溶液与磷酸缓冲液或者人工海水混合培养过夜后室温离心；第二步是热激，即在冰浴处理的MgCl2/CaCl2液体中重悬细胞颗粒，并在冰上黑暗培养后经过水浴热激；第三步是杂交，即通过加入预温杂交缓冲液后进行黑暗培养;第四步是洗涤，即通过室温离心沉淀和加入预热的洗涤缓冲液洗涤后，再重悬于磷酸缓冲液中并置于暗处冰上保存直到进行细胞分选。该方法与荧光激活的细胞分选（FACS）相结合，可对模拟细菌群落和自然细菌群落中特定的细菌分类群进行分类，尤其是对属于探针目标所定义的特定分类组的革兰氏阳性和革兰氏阴性活细菌，并随后进行分选与培养［14］。Dam等在研究结合单细胞基因组学靶向细胞分选方法捕获低丰度微生物暗物质时采用了无固定荧光原位杂交（FISH）技术对乌拉圭酿酒厂废水处理厂中的绿弯菌进行了荧光标记，并且利用FACS对标记细胞进行单细胞分选。使用目标细胞分选富集未培养的绿弯菌，该菌在环境样本中的丰度低于总菌群的1%，结合单细胞测序技术从乌拉圭酿酒厂废水中共获得了19个绿弯菌物种的基因组草图，该研究提供了一种灵敏的方法来捕获环境中丰度极低的目标微生物类群［62-63］。Chloroflexi（绿弯菌）虽然在深海、热泉和工业废水中广泛分布，但其仍是一类难培养微生物。该方法实现了难培养微生物的靶向分离与培养，为科研工作者提供了研究基础。

图2 基于Live-FISH技术的单细胞分离方法Fig.2 Single cell separation method based on Live-FISH technique

2.2 基于反向基因组学的单细胞分离方法

在最近的一项研究中，Cross等［15］报道了一种利用基因组信息抗体工程技术从复杂群落捕获特定微生物继而达到纯培养的方法。此研究填补了非分类特异性细胞染色之间的空白，这种染色既能标记细胞，又能保持细胞活力，而且具有一定的分类特异性。该工作被称为反向基因组学对未培养细菌的定向分离和培养的有效方法，主要研究步骤如图3所示［15］，包括确定SAG和MAG中膜蛋白编码基因，选择预测暴露的表位，制备抗体，进行蛋白纯化和微生物荧光标记，对微生物组样本中的靶细胞染色以及最后的靶细胞的分离、基因组测序或培养。该研究应用反向基因组学方法分离和测序单细胞并成功培养了人类口腔Saccharibacteria（TM7）的3个不同物种。TM7是基于16S rRNA基因序列提出的第一个候选细菌门之一，并已在活性污泥和人类口腔等许多环境中被发现［64］。使用此分类培养方法，研究人员证明了这3个Saccharibacteria（TM7）物种都是放线菌门下不同的寄生菌，他们还分离和培养了人类口腔SR1细菌，这是一个以前未培养的细菌谱系的成员。该方法中抗体标记的细胞也可以被输送到其他平台，以实现高通量细胞分离，例如，微滴或芯片。该研究还表明微生物的反向基因组培养方法可以应用于任何环境下的任何物种，并有可能分离、培养和鉴定微生物树中尚未培养的新物种。由此可见，随着分离技术的进步，使微生物特异性分离逐步成为现实。

图3 基于反向基因组学的微生物靶向分离Fig.3 Targeted isolation of microorganisms based on reverse genomics

3 微生物单细胞分离方法的优点与不足

这些单细胞分离方法各有其特点，对微生物单细胞分离具有重要推动作用（表1），可将其分为两类，一是高通量分离方法，包括膜扩散培养法、微流控技术、单细胞拉曼分选及荧光激活细胞分选技术。膜扩散培养法通过对未培养微生物原位培养来达到分离微生物的效果，可增加微生物的可培养率，但是该分离培养方法耗时久、工作量大、不具有特异性，主要是通过获得大量培养物达到菌株分离的效果［65］。微流控技术能够使用非常少量的样品和试剂，并以高分辨率和灵敏度进行分离和检测，具有低成本、分析时间短、分析设备占用空间小、对细胞微环境控制能力强等优点［66］。微流控技术也可以与一些其他技术如流式细胞仪或者拉曼光谱技术联用来分离单细胞，但是其通用性比较低，在单细胞分选过程中除了部分方法外往往需要标记，这也可能会对细胞造成一定的损伤［67-68］。单细胞拉曼技术分选效率高，无创、无标记，但是该技术对仪器要求较高，自发拉曼光谱信号比较弱，分选不具有特异性，目前只能通过拉曼光谱对某些微生物进行选择性分离［69］。荧光激活细胞分选具有技术成熟、高灵敏度、高通量的特点，其在基础研究和临床研究中均得到了广泛的应用，但仍存在一些局限性。首先，FACS是依赖于流式细胞仪为实验基础，需要大量悬浮细胞，它不能从低数量的细胞群中分离出单个细胞。其次，机器内的快速流动和非特异性荧光分子会损害分选细胞的活力，导致分离失败［32］。另一类分离方法是靶向分离方法，对目标细胞具有选择性，包括Live-FISH及反向基因组学方法。Live-FISH主要通过对环境样品进行活细胞荧光标记，再结合流式细胞仪进行细胞分选［14］。该方法靶向分离细胞效果较强，但耗时久、对细胞破坏性大、成活率低。反向基因组学方法依赖抗体结合靶细胞表面暴露的抗原表位进行标记，适用性广泛，但是靶向性不强，结合流式细胞分选会附带许多非目标菌株，也会损伤细胞。此外还有一些其他类的单细胞分选方法，虽然不能做到高通量分离或者靶向分离，但是他们在单细胞分离方面仍具有重要作用，如光镊技术、显微操作技术等。光镊技术在单细胞分离方面精度高、效率高，但在生物研究中应用光镊通常用于光学捕获的红外（IR）光会导致细胞损伤［38］。显微操作技术适用范围广，可以分离选定的细胞，但是分离效率低，容易损伤细胞而造成细胞的成活率降低［70］。对于这些微生物单细胞分选方法，均有其各自的优缺点，因此，在微生物分离过程中需明确研究目的，才能更好地选择和应用合适的分离技术来达到研究目标。

表1 微生物单细胞分离方法的优点及不足Table 1 Advantages and disadvantages of single cell separation methods for microorganisms

4 总结与展望

单细胞分析在生命科学领域有很大的应用前景，本文主要概述了多种单细胞分离方法的研究进展，包括具有高通量分选单细胞的分离方法，具有靶向分离单细胞的方法，以及其他的一些单细胞分离方法。这些分离方法各具特色，既有优点，也有不足，随着科技的不断进步和发展，未来单细胞分离技术应该在以下几个方面进行提升。首先，是减小细胞损伤。虽然目前单细胞分选技术为我们的科学研究提供了技术支持，但是大多数的单细胞分离方法存在损伤细胞的问题，例如，显微操作、光镊技术、荧光激活细胞分选等过程中导致的细胞变形、功能改变，甚至细胞死亡等。因此，首先要改进的就是在保持分选效率的情况下减少对细胞的损伤。其次，改进单细胞靶向分离技术。虽然目前已有研究实现了环境中微生物的靶向分离，如Live-FISH技术、基于反向基因组学的分离技术，但是这些技术对于单细胞分离是十分有限的，并不是环境中的所有目标微生物都能实现标记，许多微生物没有现有的生物标志物，或者目标细胞难以用荧光探针标记，可能会标记到非目标微生物。目前的应用仍只是环境中丰度高的类群或者特殊的类群，并且这两种分离方法需要结合流式细胞仪进行分选，流式细胞仪分选细胞需要大量悬浮细胞，而且此过程也会损失和损伤目标细胞。虽然这两种靶向分离方法有明显的不足，但也是目前已有的最先进的靶向分离方法，期待在未来随着技术的进步，可以改进微生物标记探针提高其特异性以及标记后的细胞分选技术减少活细胞损失和损伤，从而弥补这些技术在靶向识别、高通量分选等方面的不足，更好地为未培养微生物资源等科研服务。第三, 发展新型单细胞分离技术。目前，Doudna团队已经实现复杂细菌群落中物种和特定位点的基因组编辑［71］，因此希望未来基因编辑技术或者其他技术能够成功发展和应用到微生物的靶向分离中。第四，拓展单细胞分离技术的应用。单细胞分离技术在很多领域已经显示出其广泛的应用前景，期待在环境样本中微生物分离、药物分子筛选、肿瘤细胞筛选、细胞器分选、生物医学和临床诊断等方面能得到实际应用，真正将科学研究应用到实处，服务于人类社会发展。