基于CRISPR/CasX介导的水稻基因组编辑技术的建立

李雪琪 张素杰 于曼 黄金光 周焕斌

（1.青岛农业大学植物医学学院，青岛 266109；2.中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100093；3.农业农村部桂林作物有害生物科学观测实验站，桂林 541399）

基因组编辑技术是在基因组水平上对DNA序列进行定点改造和修饰的一种新兴的基因工程技术，它在基因功能研究、植物遗传改良和分子育种等方面发挥着重要的作用［1］。其中CRISPR/Cas介导的基因组编辑系统由于设计简单、低成本和高精准性等特点，被广泛应用于改良植物遗传性状，包括提高产量、提高植物病虫害抗性以及提高抗逆性等［2-3］。

CRISPR/Cas系统是存在于原核生物中的一种天然免疫系统，根据效应复合物和Cas蛋白的不同，CRISPR/Cas系统分为两大类、六种类型和若干亚型。其中Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cas12蛋白，是目前应用最广泛的CRISPR/Cas系统［4］。

CRISPR/SpCas9系统由两部分组成：SpCas9核酸酶和single guide RNA（sgRNA），sgRNA是通过CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）的融合组成的［5］，Cas9有两个不同的核酸酶结构域：HNH和RuvC-like，其中HNH切割靶标DNA链，RuvC-like切割含PAM序列的非靶标DNA链［6］。常用的SpCas9识别NGG PAM［7］，这种特定的PAM要求限制了CRISPR系统可编辑的区域。为了拓展CRISPR/Cas系统对不同PAM序列的兼容性，需要挖掘出新的识别不同PAM的天然Cas9蛋白或人工改造的Cas9变体。例如，不同来源的SpCas9的天然同源物ScCas9、SaCas9以及St1Cas9等，并已被证明分别可以识别NNG、NNGRRT和NNAGAAW PAM序列［8-10］。SpCas9定向进化产生的突变体SpRY、xCas9和Cas9-NG能够识别含G-PAM和A-PAM［11-13］。

Cas12核酸酶属于V型CRISPR系统，包含Cas12a-Cas12k几种变体，是一种单一的RNA引导的内切酶，不需要tracrRNA，只需要crRNA就能进行打靶。Cas12a（又称Cpf1）是第一个广泛用于基因组编辑的Cas12核酸酶，具有DNA和RNA内切酶活性，与Cas9蛋白不同的是Cas12a仅需要一个切割结构域即可在靶位点处产生DSBs［14］。另一方面，Cas12a可以靶向植物基因组中富含T的序列，弥补了Cas9只能识别富含G的序列的缺陷，进一步扩大了CRISPR/Cas系统的打靶范围［15］。

Cas12e（又称CasX）是通过对地下水中的细菌进行宏基因组分析而确定的，CasX具有两个同源蛋白，来自Deltaproteobacteria的CasX（以下称为DpbCasX）和来自Planctomycetes的CasX（以下称为PlmCasX），它们具有68.5%的序列相似性。基于该蛋白建立的CRISPR/CasX系统可以通过提供一类更小的、可编程的核酸酶作为额外的治疗选择，扩展了CRISPR/Cas基因组编辑家族［16-18］。与Cas9（～1 300 aa）或Cas12a（～1 200 aa）相比，CasX（～980 aa）足够小，可以通过单个AAV传递，并有额外的空间用于多重单向导RNA（gRNA）或蛋白质域融合［19-21］。与SpCas9蛋白识别NGG PAM和Cas12a蛋白识别TTTV PAM位点不同的是，CasX蛋白能够识别TTCN PAM序列位点。因此，本研究通过利用PlmCasX和DpbCasX蛋白，建立基于CRISPR/CasX介导的水稻基因编辑系统，扩大基因编辑技术在水稻中的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 均来自早熟水稻粳稻品种Kitaake，收获的青种子主要用于水稻遗传转化，熟种子用于原生质体制备。

1.1.2 菌株、质粒及试剂 本研究所用的菌株和质粒见表1。酵母粉、胰蛋白胨、细菌用琼脂粉、植物组培用琼脂粉、2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸和6苄基腺嘌呤购自北京索莱宝公司。潮霉素、特美汀、乙酰丁香酮、氨苄青霉素、氨苄青霉素、硫酸卡那霉素和利福平购自上海翊圣生物科技公司。十六烷基三甲基溴化铵、溴化乙锭购自北京冰达生物科技公司。NaCl、三氯甲烷、异丙醇、乙醇、Tris、甘露醇、山梨醇和蔗糖等常用试剂购自国药集团。质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术公司、胶回收试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。T4 DNA Ligase、ATP、T4 polynucleotide kinase等购自TaKaRa。Bsa I、Sap I购自NEB。PCR扩增用的高保真酶2× TransStart® FastPfu PCR SuperMix购自北京全式金生物技术公司，Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme Mix购自Invitrogen。

表1 载体与菌株Table 1 Bacterial strains and plasmids

1.1.3 所用引物 实验中用到的引物的合成及测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成（表2）。

表2 引物序列信息Table 2 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1 CasX表达载体的构建 人工合成DpbCasX和PlmCasX两个片段，通过BamH I/Spe I双酶切将合成的基因片段克隆至瞬时表达载体pUC19中，由CaMV 35S启动子驱动表达，同时克隆至双元表达载体pUbi中，由玉米泛素蛋白启动子（Ubi-p）驱动表达，分别构建pUbi-DpbCasX、pUbi-PlmCasX和pUC19-DpbCasX、pUC19-PlmCasX四个载体（图1-A-B）。

图1 载体示意图Fig.1 Schematics of vector

MIDAS（Improving Editing Activity by Synergistic Engineering）是一种蛋白质工程化改造的新方法，能显著增强PlmCasX在人类细胞中的基因组编辑活性［22］，MIDAS（T26R/K610R/K808R）突变体的构建方法：分别用引物对pUbi-PlmCasX-F1/R1、pU-bi-PlmCasX-F2/R2、pUbi-PlmCasX-F3/R3、pUbi-Plm-CasX-F4/R4（表2）以PlmCasX合成片段为模板进行PCR扩增，回收纯化后进行infusion连接，命名为PlmCasX-V1。最后通过BamH I/Spe I双酶切，分别连接到双元载体和pUC19骨架上，构建pUbi-PlmCasX-V1和pUC19-PlmCasX-V1两个载体。

1.2.2 crRNA的设计及打靶载体的构建 利用具有核酸酶活性的HDV核酶单元、tRNA、CRISPR/CasX系统的crRNA靶序列间隔DNA修复模板，使用CaMV 35S启动子和Nos终止子，命名为CasX-crRNA交由生工合成（图1-C），与用Bsa I酶切后的pENTR4-gRNA41载体连接，经酶切验证及测序，最终得到正确质粒，命名为pHZ38。

gRNA的设计：根据水稻基因组数据中内源基因序列，寻找PAM位点为TTCN（TTCA、TTCT、TTCC、TTCG）的合适靶点。使用Bsa I酶切位点时正向引物的黏性末端为aaag，反向引物为ggcc；使用Sap I酶切位点时的正向引物的黏性末端为aag，反向引物为gcc。

gRNAs的构建方法参考文章［23］。

互补的引物对（表2）经磷酸化处理后通过热处理后自然冷却结合成双链，然后插入经Bsa I或Sap I酶切后的pHZ38载体中。通过gateway的LR反应将gRNA插入到双元载体pUbi-DpbCasX、pUbi-PlmCasX和pUbi-PlmCasX-V1中，最终转入农杆菌EHA105中用于水稻遗传转化。

1.2.3 水稻原生质体转化 PEG介导的水稻原生质体的转化方法参考李超的文章［24］。将pUC19载体和gRNA载体通过PEG介导的水稻原生质体转化导入水稻细胞中进行共表达，转染48 h后收集并提取原生质体DNA，利用OsCPK16基因的特异引物（表2）进行PCR扩增和高通量测序，鉴定靶位点是否发生基因编辑。

1.2.4 农杆菌转化 本试验中农杆菌介导的水稻稳定遗传转化方法参考Hiei等［25］和Nguyen等［26］的方法。双元载体pUbi-DpbCasX、pUbi-PlmCasX及pUbi-PlmCasX-V1对含有不同TTCN（TTCA、TTCT、TTCC、TTCG）PAM序列的水稻内源基因进行打靶后，转入用未成熟的Kitaake种子诱导出的水稻愈伤中进行水稻遗传转化。

1.2.5 编辑效率检测 采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法提取水稻原生质体基因组DNA，采用磁珠法提取水稻转基因材料的基因组DNA，通过高通量测序的方法对编辑效率进行分析。

首先根据常规PCR引物设计原则进行引物设计（18-22 nt）：检测位点必需在正向或反向引物附近（10-60 bp范围内），扩增长度为150-200 bp；在正向引物前端加搭桥序列5′-ggagtgagtacggtgtgc-3′，反向引物前端加搭桥序列5′-gagttggatgctggatgg-3′。以提取的基因组DNA为模板，并用2× Rapid Taq Master酶进行第一轮扩增，PCR反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量，确认所有样品条带亮度一致且特异后，以第一轮扩增产物为模板，barcoded引物（合成12条barcoded正向引物，9条barcoded反向引物）进行第二轮扩增，将所有的PCR产物等量混合，直接纯化回收构建文库，检测文库的DNA浓度，送给公司上机测序。最后对数据进行处理，根据不同的引物序列对每个样品进行拆分，分析基因编辑的效率。

2 结果

2.1 CRISPR/DpbCasX编辑活性的检测

已有报道表明DpbCasX具有在大肠杆菌细胞中切割靶基因的能力，而其失活的对应物能够结合靶基因并降低基因表达。首先对DpbCasX基因按照水稻密码子使用偏好性进行了密码子优化后进行人工合成，后克隆至瞬时表达载体pUC19中，用于水稻原生质体瞬时表达检测DpbCasX的编辑活性。以水稻内源基因OsCPK16作为目的基因，设计以TTCT为PAM的gRNA插入pHZ38中，在水稻细胞中表达DpbCasX的gRNA。

将表达CasX蛋白的pUC19载体和携带靶位点gRNA的pHZ38载体通过PEG介导的方法共转化水稻原生质体，并对靶位点进行编辑活性检测。通过高通量测序结果显示（图2），pUC19:DpbCasX与gRNA共转化后，实现了对水稻内源基因OsCPK16的有效编辑，且在DpbCasX蛋白处理下引起的靶位点的突变在-7 - -23 bp之间。上述结果证明以TTCT为PAM的CRISPR/DpbCasX系统在水稻中具有编辑活性。

图2 CRISPR/DpbCasX系统打靶OsCPK16基因在水稻原生质体中的编辑效率Fig.2 Editing efficiency of OsCPK16 gene targeted by CRISPR/DpbCasX system in rice protoplasts

2.2 基于CRISPR/DpbCasX介导的水稻基因编辑技术的建立

接下来通过水稻稳定遗传转化实验进行进一步的验证。本研究将DpbCasX合成片段通过BamH I和Spe I酶切克隆至双元表达载体pUbi中，并选择了水稻内源基因OsCPK30和OsCPK4能够识别TTCG PAM序列的靶位点、水稻内源基因OsCPK21能够识别TTCA PAM序列的靶位点、水稻内源基因OsCPK23和OsCPK14能够识别TTCC PAM序列的靶位点以及水稻内源基因OsCPK11和OsCPK27能够识别TTCT PAM序列的靶位点进行打靶实验（表3），利用农杆菌介导的水稻稳定遗传转化检测其编辑效率，通过PCR扩增和高通量测序对获得的独立转基因水稻品系进行基因型分析。结果显示（图3），DpbCasX蛋白只在打靶含TTCA PAM识别位点的水稻基因OsCPK21实验中有编辑效率，得到的40株转基因独立株系中，检测到7株发生了编辑，编辑效率为17.5%，发生编辑的突变材料中，有5株为单等位基因突变，2株为双等位基因突变，且靶位点在DpbCasX蛋白处理下引起的突变在-7- -10 bp之间。

图3 CRISPR/DpbCasX和CRISPR/PlmCasX系统打靶OsCPK4和OsCPK21基因高通量测序结果比较Fig.3 Comparison of high-throughput sequencing results of OsCPK4 and OsCPK21 genes targeted by CRISPR/DpbCasX and CRISPR/PlmCasX systems

表3 DpbCasX、PlmCasX编辑效率比较Table 3 Comparison of editing efficiency among DpbCasX and PlmCasX

2.3 基于CRISPR/PlmCasX介导的水稻基因编辑技术的建立

为了进一步建立水稻CRISPR/CasX系统，又对PlmCasX基因按照水稻密码子使用偏好性进行了密码子优化后进行人工合成，克隆至瞬时表达载体pUC19中。以水稻内源基因OsCPK16作为目的基因，将表达CasX蛋白的pUC19载体和携带靶位点gRNA的pHZ38载体通过水稻原生质体瞬时表达检测PlmCasX的编辑活性。通过高通量测序结果显示（图4），pUC19: PlmCasX与gRNA共转化后，也能实现对水稻内源基因OsCPK16的有效编辑，且在PlmCasX蛋白处理下引起的突变在-8- -23 bp之间。证明了以TTCT为PAM的CRISPR/PlmCasX系统在水稻中具有编辑活性。

图4 CRISPR/PlmCasX系统打靶OsCPK16基因在水稻原生质体中的编辑效率Fig.4 Editing efficiency of OsCPK16 gene targeted by CRISPR/PlmCasX system in rice protoplasts

之后我们又将PlmCasX合成片段通过BamH I和Spe I酶切克隆至双元表达载体pUbi中，并选择了水稻内源基因OsCPK30和OsCPK4能够识别TTCG PAM序列的靶位点、水稻内源基因OsCPK21能够识别TTCA PAM序列的靶位点、水稻内源基因OsCPK23和OsCPK14能够识别TTCC PAM序列的靶位点以及水稻内源基因OsCPK11和OsCPK27能够识别TTCT PAM序列的靶位点进行打靶实验（表3），利用农杆菌介导的水稻稳定遗传转化检测其编辑效率，通过PCR扩增和高通量测序对获得的独立转基因水稻品系进行基因型分析。结果显示（图3），PlmCasX蛋白在打靶含TTCA PAM识别位点的水稻基因OsCPK21实验中有编辑效率，得到的56株转基因独立株系中，检测到37株发生了编辑，编辑效率为66.07%，发生编辑的突变材料中，有22株为单等位基因突变，15株为双等位基因突变，且靶位点在PlmCasX蛋白处理下引起的突变在-7- -13 bp之间。在打靶含TTCG PAM识别位点的水稻基因OsCPK4实验中，得到的56株转基因独立株系中，检测到13株发生了编辑，编辑效率为23.21%，也主要以单基因突变为主，并且大多数突变株在靶位点处产生的基因突变基本都在-7- -16 bp之间的基因突变。

2.4 水稻CRISPR/CasX系统的优化

为了进一步提高PlmCasX系统的编辑效率，本研究试图用MIDAS方法对PlmCasX蛋白进行了优化，构建了基于PlmCasX-V1（T26R/K610R/K808R）的新系统，并对上述7个水稻内源基因（OsCPK11、OsCPK21、OsCPK23、OsCPK30、OsCPK4、OsCPK14、OsCPK27）进行打靶实验，这些基因的PAM序列包含所有的TTCN PAM（TTCA、TTCC、TTCT、TTCG），通过PCR扩增和高通量测序对获得的独立愈伤进行基因型分析。结果发现PlmCasX-V1在这7个靶位点都不具有编辑活性。

2.5 靶位点脱靶分析

将OsCPK4和OsCPK21靶位点的序列通过网站CRISPR-GE（http://skl.scau.edu.cn/）进行检索，查找潜在的脱靶基因，发现OsCPK4基因不存在含有4个及4个以下错配碱基的靶位点，而OsCPK21存在含有两个错配碱基和一处缺失的潜在脱靶位点，设计特异性引物PCR扩增后进行Sanger测序（图5），结果显示均未发现脱靶现象。

图5 OsCPK21基因潜在脱靶情况Fig.5 Potential off-target situation of OsCPK21 gene

3 讨论

Cas9和Cas12系统通过PAMs区分自身和非自身DNA靶，并产生双链断裂。Cas9识别富含G的PAM并产生被RuvC和HNH结构域切割的平末端，而Cas12识别富含T的PAM并产生仅被RuvC结构域切割的黏性末端，CasX则是一种新鉴定的能识别TTCN PAM序列的具有双RNA导向的DNA靶向核酸酶的DNA切割特性［21］。基于CRISPR/CasX系统的建立，突破了SpCas9蛋白识别NGG PAM位点和Cas12a蛋白识别TTTV PAM位点的限制，在动植物基因组编辑中具有极大的潜力。有研究表明，在哺乳动物中CasX与Cas9和Cas12a相比具有更低的错配耐受性，这表明CasX具有高保真度和低脱靶编辑，并且在哺乳动物中PlmCasX的编辑效率要高于DpbCasX［27］。本研究通过水稻原生质体转化和水稻稳定遗传转化检测到PlmCasX和DpbCasX在水稻内源基因中均有编辑活性，但原生质体中使用含有TTCT PAM的靶位点能检测到编辑活性，而在水稻稳定遗传转化的时候含TTCT PAM的靶位点并未检测到编辑活性，这可能是因为靶位点不同，可能存在编辑位点依赖性，同时TTCT PAM的编辑活性较低，无法在稳定遗传转化中检测到，需要进一步实验验证。

Cas12a的同源蛋白LbCas12a和AsCas12a已被证实可以在水稻中实现基因编辑，在crRNA为23 nt时，LbCas12a和AsCas12a处理的样品都能检测出编辑效率，且在靶位点引起的突变基本都在-6- -12 bp之间［28］，而本研究证实了CRISPR/DpbCasX和CRISPR/PlmCasX系统能够产生-7- -23 bp碱基的突变，为创造新的水稻突变体提供了条件。

有研究构建了CasX衍生型的稳定活性构象状态的工程变体，使其在体外将催化效率提高了10-20倍，在人体细胞中平均编辑效率提高了2-3倍［29］。而本研究通过MIDAS对PlmCasX蛋白进行优化，构建了PlmCasX-V1突变体，没有检测到该突变体在水稻中的编辑活性。据报道，在哺乳动物细胞中经过MIDSA处理的PlmCasX蛋白比野生型的PlmCasX蛋白的编辑效率高52%，而本研究中的靶位点均没有编辑活性，这可能是因为本实验选取的靶位点与该报道中的位点有差异，其只在哺乳动物中有编辑活性，在植物中是否可行还需要我们进一步实验验证。

综上所述，本研究建立的基于CRISPR/CasX的水稻基因编辑系统，为将来开发基于CRISPR/CasX系统的碱基编辑工具和引导编辑工具，用于基因功能研究、遗传性状改良和分子作物育种提供了良好的技术支撑。

4 结论

本研究通过比较CasX的两个衍生型蛋白PlmCasX和DpbCasX对不同水稻内源基因的编辑效率，建立了基于CRISPR/CasX介导的水稻基因编辑系统，且其能识别TTCR PAM这一特性，扩大了基因编辑技术在水稻中的应用范围。