上清丸黄柏中盐酸小檗碱含量测定及关黄柏掺伪或替代投料的检查

肖琳婧 秦学玲 付兴情 金 蒙 龙 琴 张赟华

云南省食品药品监督检验研究院，云南 昆明 650106

上清丸源自《丹溪心法》“朱丹溪方上清散加减”[1]，但与现行处方一致的上清丸最先记载于《北京市中药成方选集》[2]。现标准收载于卫生部药品标准中药成方制剂第十册，标准编号为WS3-B-1878-95，标准收载大蜜丸和水丸两种剂型，后根据药典业发(1999)第175号文增加水蜜丸的规格。上清丸由菊花、薄荷、川芎、白芷、荆芥、防风、桔梗、连翘、栀子、黄芩(酒炒)、黄柏(酒炒)及大黄(酒炒)十二味药材组成。具有清热散风、解毒通便的功效。临床上常用于头晕耳鸣、目赤、鼻流黄涕、口舌生疮、牙龈肿痛、大便秘结[3]。文献[4-6]报道，可采用HPLC方法对上清丸中的欧前胡素、黄芩苷、绿原酸、蒽醌等成分进行含量测定，但对上清丸中关黄柏掺伪及黄柏中盐主要活性成分盐酸小檗碱含量测定未见报道。

长期以来黄柏的价格高于关黄柏，因其化学成分相似，黄柏药材在市场上常有用关黄柏冒充或掺入正品黄柏中使用的情况存在，与正品黄柏相比，关黄柏中盐酸小檗碱与盐酸巴马汀含量相近，而正品黄柏二者含量差异较大，以关黄柏代替黄柏或两者混合入药势必会影响药效[7-11]。上清丸现行质量标准仅对黄柏行显微鉴别，存在关黄柏掺伪或替代投料的风险，为打击关黄柏替代或掺伪黄柏投料生产上清丸的违规行为，非常有必要建立HPLC法测定上清丸中盐酸巴马汀及盐酸小檗碱含量，并通过其峰面积的比值对关黄柏掺伪或替代投料进行检查。

上清丸为2022年全国药品抽检中成药重点监管品种之一，本次专项抽验，共抽取上清丸样品103批次。抽样地域覆盖了全国26个省、自治区、直辖市，涉及14家生产企业，包括大蜜丸、水丸、水蜜丸3种剂型。本实验采用了HPLC测定了103批样品中黄柏2个生物碱的含量，并通过盐酸巴马汀与盐酸小檗碱峰面积的比值，对上清丸中对关黄柏掺伪或替代投料进行检查。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪；赛多利斯BS224S电子天平；赛多利斯SECURA225D电子天平。

A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.缺黄柏阴性供试品溶液

1.2 试药 盐酸小檗碱对照品(批号：110713-201814，含量以86.7%计)、盐酸巴马汀对照品(批号：110732-201913，含量以85.7%计)、黄柏对照药材(批号：121510-201807)、关黄柏对照药材(批号：120937-201408)均购自中国食品药品检定研究院，另购买5批黄柏药材，均经鉴定，甲醇为色谱纯(默克公司)，水为纯化水，甲醇、乙醇、磷酸等其他试剂均为分析纯。

1.3 样品 方法学考察用的上清丸(水蜜丸，批号：A12003，广州白云山陈李济药厂有限公司生产)，其余103批次上清丸样品来源于14家生产企业，由于国家专项抽检，涉及数据保密，生产企业由A～N代替。具体信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Waters xbridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(加入磷酸二氢钾使其达到0.02 mol/L)(20∶80)等度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长345 nm，柱温25 ℃，进样量为5 μL，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于4000。

2.2 对照品溶液的制备 分别取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL含取盐酸小檗碱50 μg、盐酸巴马汀 5 μg 的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品重量差异项下大蜜丸，剪碎，精密称定，取约2 g；取水丸或水蜜丸适量，研细，取约1 g，置具塞三角锥形瓶中，精密加入盐酸∶甲醇(1∶100)25 mL，称定重量，超声40 min，放冷，再称定重量，用盐酸∶甲醇(1∶100)补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性供试品溶液的制备 按处方比例，在实验室模拟工艺，配制缺黄柏细粉，取约1 g，同供试品溶液制备，即得阴性供试品溶液。

2.5 系统适应性与专属性试验 按“2.2、2.3、2.4”项下制备的对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品，在上述试验条件下，采用紫外检测器检测，测定，记录色谱图，如图1所示。结果表明上述液相色谱条件下，供试品溶液色谱中呈现与对照品保留时间相同的色谱峰，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀与相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论板数以盐酸小檗碱峰计均不低于4000，阴性供试品在相应位置处未见色谱峰，表明其他药味不干扰两种待测成分的测定，方法专属性良好。

2.6 线性关系考察 精密称定盐酸小檗碱对照品10 mg置于20 mL量瓶中，盐酸小檗碱母液(C=500 μg/mL)；精密称定取盐酸巴马汀10 mg置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀，得盐酸巴马汀母液(C=100 μg/mL)；精密吸取盐酸小檗碱母液5 mL、5 mL、1 mL、1 mL置于10 mL、25 mL、10 mL、100 mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，再精密吸取小檗碱稀释液(C=100 μg/mL)1 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀即得系列线性溶液；精密吸取盐酸巴马汀母液精密吸取5 mL、5 mL、1 mL、1 mL置于10 mL、25 mL、10 mL、100 mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，再精密吸取巴马汀稀释液(C=50 μg/mL)1 mL置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀即得系列线性溶液。

精密吸取上述线性对照品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行测定。以各成分进样量为横坐标，相应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，线性测定数据、计算得回归方程及相关系数见表2。

表2 线性关系考察表

2.7 精密度试验 取混合对照品适量，按上述方法制备，连续6次测定，测得盐酸小檗碱、盐酸巴马汀的峰面积RSD (n=6)分别为1.54%、1.58%，仪器的精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h各进样1次，测定各组分的峰面积，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀峰面积RSD(n=6)分别为0.55%、1.06%，样品溶液在24 h内基本稳定。

2.9 重复性试验 取上清丸(水蜜丸，批号：A12003，广州白云山陈李济药厂有限公司)按“2.3.2”项下操作，平行提取6份，测得结果见表3，表明该方法重复性良好。

表3 重复性试验结果

2.10 加样回收试验 取已知含量的上清丸样品(盐酸小檗碱1.42 mg/g、盐酸巴马汀0.02 mg/g、)上清丸(水蜜丸，批号：A12003，广州白云山陈李济药厂有限公司生产)，称定6份，每份取约0.5 g，精密称定，采用加样回收试验方法，分别按下表精密加入两种对照品溶液，具体称样量、加入量。测定结果见表4，表明该方法可行。

表4 加样回收率实验结果

2.11 限度设定和结果分析 为研究黄柏关黄柏掺伪或替代投料，拟定其限度，按照2.3项下方法制备供试品溶液，计算盐酸巴马汀和盐酸小檗碱峰面积比值，具体见表5。考虑不同产地黄柏和关黄柏药材的区域性差异及样品收集的局限性，以0.05为限度，即F值不得大于0.05[10]，可较好地区分上清丸中以关黄柏掺伪或替代正品黄柏投料。

表5 各样品中A盐酸巴马汀/A盐酸小檗碱比值的情况

取上清丸103样品，按照2.3项下方法制备供试品溶液，各精密吸取5 μL，注入HPLC中，计算盐酸小檗碱的含量及盐酸巴马汀和盐酸小檗碱峰面积比值，结果见表6。各生产企业盐酸小檗碱的含量统计图如图2所示，盐酸巴马汀和盐酸小檗碱峰面积比值如图3所示。

图2 不同生产企业上清丸盐酸小檗碱含量统计图

图3 不同生产企业上清丸盐酸小檗碱含量统计图

表6 103批次上清丸盐酸小檗碱含量测定结果及比值

结果表明上清丸(大蜜丸)中盐酸小檗碱含量差异较小，盐酸巴马汀和盐酸小檗碱峰面积比值均小于0.05，说明不同生产企业黄柏质量把关较严，均未出现关黄柏掺伪或替代投料的问题。上清丸(水丸)中盐酸小檗碱与企业相关性较强，L企业盐酸小檗碱含量较M和N企业低，但均未出现盐酸巴马汀和盐酸小檗碱峰面积比值均大于0.05的情况。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 研究比较不同提取溶剂(60%乙醇、甲醇、盐酸∶甲醇=1∶100)，不同提取方式(超声20 min、40 min、60 min)，最终确定最佳提取条件是盐酸∶甲醇(1∶100)超声提取40 min。此条件提取较完全，通过上述色谱条件，可以较好地测定上清丸中盐酸小檗碱及盐酸巴马汀含量。

3.2 检测波长的选择 研究通过二极管阵列检测器检测，盐酸小檗碱及盐酸巴马汀在345 nm波长附近均最大吸收并参照中国药典2020年版一部关黄柏含量测定项下的规定[12]，选择345 nm为测定波长。

3.3 流动相的选择 实验在筛选流动相时，通过对乙腈-水、甲醇-水的运行，筛选出乙腈-水系统优于甲醇-水系统，但色谱峰出现了拖尾现象，进而以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，但拖尾情况未完全解决。最后以乙腈-0.1%磷酸(加入磷酸二氢钾使其达到0.02 mol/L)水溶液为流动相等度洗脱时，供试品中盐酸小檗碱及盐酸巴马汀达到基线分离，峰型较好，并且干扰较少，出峰时间适中，故选取此条件为流动相。

3.4 结果分析 通过测定103批上清丸中盐酸小檗碱含量，上清丸(大蜜丸)中各企业样品含差异较小，但同一企业各批次间含量差异较大，说明各批次间均一性较差。为了提高上清丸的一致性，相关企业应加强对投料黄柏的质量控制。上清丸(水丸)中L企业样品较M、N企业低，说明L企业黄柏的质量较差，提示该企业应加强对黄柏质量的控制。在上清丸中关黄柏掺伪或替代投料检查中，所有企业黄柏投料把关较严，盐酸巴马汀和盐酸小檗碱峰面积比值均小于0.05，未出现关黄柏掺伪或替代投料的情况。

实验建立HPLC的方法测定上清丸盐酸小檗碱的含量，对市售上清丸中关黄柏掺伪或替代黄柏投料进行检查。所建立的方法操作简单、结果准确，不同企业不同批次上清丸中盐酸小檗碱含量存在一定差异，可能与制剂生产所用黄柏的产地、来源、采收季节以及原药材批间质量差异等因素有关，提示相关生产企业关注黄柏原药材质量及酒炒黄柏的工艺，不断提高和完善上清丸的质量控制标准，确保上清丸质量稳定和临床疗效一致。