烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸在卵母细胞成熟及受精激活中的作用

黄丽双，刘芸

(1.中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院妇产科生殖中心,福州 350025;2.福建医科大学福总临床医学院,福州 350025)

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)简称辅酶Ⅱ,广泛存在于细胞质中尤其是线粒体内,作为电子转移载体为人们所熟知。线粒体NADP的产生依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)激酶2(NAD kinase 2,NADK2)对NAD的磷酸化[1]。NADP参与线粒体中三磷酸腺苷(ATP)的合成[2],为卵母细胞受精、胚胎发育提供所需能量。此外,NADP(H)与NAD(H)对细胞质与线粒体中的氧化还原电势共同发挥双向性作用[3],并进一步影响胚胎氧化应激水平及其发育状况;作为多种细胞内生物酶的底物,NADP可直接调节酶的作用[4]。线粒体钙振荡与卵母细胞内钙振荡息息相关,NADP在线粒体钙活动中的作用机制缺乏相关研究。近年来,有研究发现,NADP在海星卵母细胞受精之前就能有效诱导胞浆内Ca2+升高[5],但其机制未明,值得进一步研究。

一、NADP参与卵母细胞成熟、受精及胚胎早期发育过程中的能量调节

线粒体是卵母细胞胞质中含量最丰富的细胞器。生物氧化的场所在线粒体,由呼吸链传递。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)-泛醌还原酶位于线粒体的内侧,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)常位于线粒体的外侧,与NADH具有相同的功能。呼吸链中电子由NADPH传递给泛醌,线粒体中的NADH/NADPH在氧化磷酸化作用下生成ATP[6]。

NADP参与线粒体呼吸链是卵母细胞及早期胚胎所需能量的最直接来源。在胚胎的生发泡破裂及第一极体的排出这两个重要细胞事件中可观察到ATP峰的产生。受精后,第二极体排出及原核形成过程中,NADP通过ATP的合成来参与受精过程中的这两项生理活动。在第二极体排出过程中,细胞质的分裂需要微丝协助并消耗能量;而在雌雄原核的核膜、核孔复合体的重构过程中,也同样需要微管微丝的协助并消耗能量[7-8]。已有研究表明,在卵母细胞和胚胎发育过程中,ATP含量低会导致染色体分离异常,非整倍体形成[9]。此外,ATP不足还会降低卵母细胞质量,更导致植入前胚胎质量及种植率的下降。相反,卵母细胞和胚胎中ATP含量越高,生殖助孕的患者妊娠结局越好[10]。来自卵母细胞线粒体移植的研究证实,将年轻妇女的卵母细胞线粒体移植到老龄妇女的卵母细胞胞质中,后者的ATP含量明显升高,并改善了卵母细胞及胚胎发育能力[11]。可见,线粒体的活性与含量不仅决定卵母细胞质量,还影响卵母细胞受精及发育能力,而NADP作为线粒体产能的底物,对卵母细胞意义重大。

二、NADP对胚胎氧化应激水平及其发育状况的影响

NADPH作为强还原剂在合成代谢途径中发生,NADP/NADPH可反应活细胞中氧化还原电势[12]。NADP/NADPH比率保持较低,有助于活性氧(ROS)的清除[8,13]。从生发泡(germinal vesicle,GV)期至MⅡ期(第2次减数分裂),直至8细胞之前的胚胎多利用磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)进行葡萄糖代谢,并产生NADPH。NADPH可合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)保护细胞免受ROS损伤[14]。囊胚期时胚胎糖酵解阻滞缓解,葡萄糖通过糖酵解途径氧化生成ATP,同时产生ROS[15]。线粒体是产生内源性ROS的主要场所,也是ROS攻击的主要靶点。生理状态下,ROS在卵母细胞发育中发挥着细胞内信号传导的作用,增强卵母细胞的发育潜能;但过量ROS对线粒体有毒性作用,主要表现为线粒体膜磷脂被氧化和电子传递链被破坏,从而影响细胞色素C氧化酶和ATP合成酶的活性,使氧化磷酸化不能正常进行,ATP产生迅速减少,并引起线粒体进一步的损伤[15],从而可导致卵母细胞脆弱性增加,导致纺锤体不稳定、染色体异常、端粒缩短以及衰老的卵母细胞发育能力下降[16]。研究显示,高蔗糖饮食的啮齿动物与禁食的啮齿动物相比,胞质溶胶中的未结合NADP/NADPH比率增加近五倍至八倍[17];而肥胖中常见的脂质和吡啶核苷酸代谢紊乱会损害内质网钙吸收,从而导致内质网应激、破坏钙稳态[18-19]。在衰老、肿瘤与炎症反应过程中,无论是病理机制研究或是治疗,NADP作为NAD的代谢产物,其抗氧化、修复作用越来越受各个领域的关注[20]。

三、NADP参与卵母细胞内多种代谢通路的调节

NADP参与卵母细胞氧化代谢相关途径。Downs等[21]在1999年研究发现,当使用NADP依赖酶抑制剂作用于PPP时,小鼠卵丘复合物(COC)成熟度降低,这意味着该途径的葡萄糖代谢对减数分裂诱导至关重要。此外,在牛COC及猪COC中同样有报道,PPP通路影响卵细胞核成熟等进而影响卵母细胞质量[22-23],PPP可能参与减数分裂所有阶段的进展,包括减数分裂的恢复、MI～MⅡ过渡和受精后减数分裂的恢复[23]。有研究发现,NADP处理后的体外成熟牛卵母细胞虽然完成了减数分裂和胞质成熟过程,但NADP通过刺激PPP通路增加氧化和线粒体活性,并延迟线粒体迁移,使囊胚形成率下降[24];同样地,关于猪COC的体外成熟培养研究中也得出了与上述牛卵母细胞较为一致的结果[25],提示NADP的添加影响了卵母细胞的发育潜能。

据报道,在体外成熟的牛卵母细胞和卵丘细胞中,参与氨基酸代谢和三羧酸循环的NADP依赖的异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)单位保持恒定,并在卵母细胞中检测到高NADP-IDH活性;另外,添加异柠檬酸+NADP的成熟培养基可增加成熟卵母细胞的百分比,而将NADP换成柠檬酸盐的情况下,不能提高卵母细胞的成熟率,说明NADP在卵母细胞成熟过程中发挥重要作用[26]。

四、NADP对卵母细胞内钙离子的作用

NADP是烟酸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate,NAADP)的类似物,还是NAADP的前体,CD38催化NADP合成NAADP[27]。NAADP也是第二信使,可从细胞内钙库动员钙离子,调节钙离子信号传导。目前研究结果显示,NAADP介导的Ca2+动员可能与内质网介导的Ca2+动员完全不同,是一种来源于酸性细胞器上的ATP依赖性的Ca2+摄取,可能有未知机制参与其中[28-30]。研究发现,NADP通过CD38合成的NAADP可介导溶酶体Ca2+信号失调,造成神经元功能障碍,在神经退行性疾病发病机制中发挥重要作用[31];但NADP本身在神经退行性疾病中的作用有待进一步发掘。Takahashi等[5]研究发现,在生发泡破裂(GVBD)前的成熟卵母细胞存在三磷酸肌醇诱导的钙释放(IICR)以外的Ca2+释放机制,依赖于NADP的钙释放;成熟卵母细胞中NADP依赖性Ca2+释放本身并不能诱导卵母细胞成熟,其发展可能归因于成熟相关的胞浆Ca2+和pH值的增加,该过程可能代表卵母细胞对促卵母细胞成熟激素的生理反应。

线粒体Ca2+摄取的主要来源为卵母细胞内作为钙储库的内质网。内质网与线粒体之间Ca2+传递异常可同时造成内质网应激与线粒体应激,在卵泡的选择性发育、卵母细胞成熟中发挥间接作用[32]。但NADP作为线粒体氧化磷酸化底物,在其中的作用机制缺乏相关研究。研究发现,线粒体可调节受精过程中的钙振荡,通过增加钙振荡来诱发氧化磷酸化产生ATP[33-35],而线粒体产生ATP又可以支持胞质内的钙离子迅速转入内质网中,维持钙振荡正常模式[36-37]。同时,线粒体在Ca2+振荡过程中吸收Ca2+,启动自身振荡,刺激线粒体氧化还原状态,增加GV期卵母细胞的ATP水平[38];线粒体Ca2+超载可导致小鼠卵母细胞线粒体氧化应激和减数分裂恢复延迟[39]。研究发现,Erastin和CGP37157均可显著抑制线粒体Ca2+通道,可使卵母细胞原核形成发育受阻[40]。已有许多研究发现衰老对钙振荡模式的影响,如老化影响钙瞬变的频率、振幅、持续时间和钙离子增加/减少的动力学、钙离子振荡的总持续时间。近年来研究者们发现衰老会降低线粒体的功能,影响受精后卵母细胞内内质网和线粒体的分布,从而影响ATP依赖的Ca2+瞬变的产生,并由此解释Ca2+振荡模式的一些改变[41]。

综上所述,NADP不仅于细胞增殖、细胞分化、细胞内物质转运时表现得相当活跃,是细胞内新陈代谢良好的表征,而且对于早期胚胎细胞中的氧化还原电势平衡也起到了很重要的作用,是抵御胚胎氧化损伤的重要物质基础。在卵母细胞减数分裂成熟过程中,NADP可充当NAADP合成底物诱发钙信号,在海星卵母细胞中也可引发钙释放,其具体作用机制不明。此外,NADP还可通过线粒体调节卵母细胞内钙振荡、维持钙稳态。我们有充足的理由相信,NADP在卵母细胞成熟及受精激活过程中起到了至关重要的作用。然而,目前有关NADP对卵母细胞的直接影响的报道仍较少,尤其是NADP影响卵母细胞内钙振荡模式的作用机制仍未可知。进一步探究NADP对卵母细胞成熟、受精激活的具体作用机制有助于增进对卵母细胞发育的了解。