马拉硫磷的纳米金适配体比色传感检测方法

田恒旗，王 耀,,*，杨海涛，李兆周，吴佳蓓，王 琳，刘浩宇，常云鹤，陈秀金,*

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.河南宜测科技有限公司，河南 郑州 451162；3.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州 贵阳 550005）

农药在保障农产品产量和质量的同时，其本身也是一把双刃剑，随着农药的种类、使用量以及农药适用范围的日益增加，相关食品安全事件频频发生，农药残留成为了影响农产品安全问题的一个重要因素[1-2]。马拉硫磷是果蔬种植过程中常用的杀虫剂，也常作为谷物储藏的保护剂。马拉硫磷虽属于低毒性化合物[3]，但长期不合理的使用会导致环境及食品中马拉硫磷残留量超标，经食物链的富集进入人体内，通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，造成肝脏以及中枢神经系统受损，严重的可导致中毒死亡[4]。长时间暴露于含马拉硫磷的环境中也可能引发心肌炎、肺水肿、胰腺炎等并发症[5]。

传统的马拉硫磷农药残留检测方法多为仪器检测法[6]，如利用质谱仪或色谱仪检测农药残留[7]，其准确性高、稳定性好，可同时检测多种成分[8]。但是传统检测方法因仪器价格昂贵、样品处理繁琐、经济成本高，多作为确证手段使用，无法满足现场即时检测需要[9]。目前马拉硫磷的快速检测方法主要有酶抑制法和免疫分析法[10]，酶抑制法的检测成本较低，易于操作，但是酶不稳定、容易失活，导致误差很大[11]。免疫分析法的特异性强，但是特异性抗体制备周期长、成本较高[12]。

适配体是通过体外筛选技术-指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的一种能特异结合待测靶标（如蛋白质或其他的小分子物质）的单链核苷酸[13]。与传统的抗体相比，适配体具有易合成、可修饰性强、结构简单、性质稳定等优势[14-15]。目前，已有多种农药被筛选出高亲和力和强特异性的适配体[16]，在此基础上，也建立了包括比色法[17]、荧光法[18]、电化学法[19]在内的多种农药残留适配体传感检测方法，推动了农药残留快速检测技术的发展[20]。

本研究以马拉硫磷特异性适配体作为识别元件、基于纳米金（gold nanoparticles，AuNPs）作为颜色指示剂，建立了马拉硫磷的适配体比色传感检测方法。本方法原理如图1所示，AuNPs是稳定的胶体溶液[21]，在高盐环境下AuNPs会发生聚集，颜色和紫外吸收光谱会发生变化，若在体系中加入适配体，通过静电吸附作用，适配体会结合到AuNPs表面，保护AuNPs在溶液中保持分散状态，不发生聚集[22]，体系颜色也不发生变化，当加入马拉硫磷后，适配体与马拉硫磷的高亲和力使得适配体会优先与马拉硫磷结合，AuNPs失去了适配体的保护，在高盐浓度下会发生聚集，溶液的颜色由红色逐渐变为蓝紫色，颜色的变化程度与添加的马拉硫磷质量浓度呈正相关。

图1 AuNPs-适配体比色传感法原理图Fig.1 Schematic diagram of the principle of colorimetric sensing method using AuNPs-based aptamer

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生菜和苹果购于本地超市。

氯金酸（HAuCl4）、柠檬酸钠、EDTA、K2CO3、马拉硫磷、毒死蜱、乐果、丙溴磷、倍硫磷、吡虫啉、敌敌畏、对硫磷标准品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈、NaCl、HCl、单宁酸（均为分析纯）天津市德恩化学试剂有限公司。实验用水均为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

马拉硫磷适配体序列参照Williams等[23]的研究，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：5’-TGT ACC GTC TGA GCG ATT CGT ACT ATG GTA TCC GAG AGG CCTACG GAA TTG TTG TAC AGC CAG TCA GTG TTA AGG AGT GC-3’。

1.2 仪器与设备

透射电子显微镜 日立科学仪器有限公司；UV-2600紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；气相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪 赛默飞世尔科技有限公司；H1650R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；pHS-3C pH计 上海雷磁仪器厂；Vortex 1涡旋混均器 德国IKA公司；JJ224BF型电子分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AuNPs的制备

使用单宁酸和柠檬酸为还原剂合成AuNPs[24]。首先，在搅拌下将1 mL质量分数为1%的HAuCl4和79 mL超纯水加入到一个烧瓶中，然后在搅拌下将4 mL质量分数为1%的柠檬酸钠、0.1 mL质量分数为1%的单宁酸、0.1 mL浓度为25 mmol/L的K2CO3和15.8 mL超纯水加入到另一个烧瓶中，将上述两种制备的溶液分别加热至60 ℃并保持30 min，然后在高速搅拌下混合在一起，直至颜色变为酒红色且不再变化，然后冷却至室温，将溶液储存在4 ℃冰箱中。

1.3.2 AuNPs-适配体比色法检测马拉硫磷

用1×TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）配制1 μmol/L马拉硫磷适配体溶液，然后将30 μL适配体溶液和150 μL AuNPs充分混匀，孵育10 min，加入30 μL马拉硫磷标准品溶液混匀，孵育10 min，再加入30 μL浓度为500 mmol/L的NaCl溶液充分混匀，反应10 min，裸眼观察溶液的颜色变化，并用UV-2600紫外-可见分光光度计扫描350～750 nm的紫外吸收光谱，记录峰值变化，配制不同质量浓度马拉硫磷标准溶液（50、100、200、300、400、800、1 500 ng/mL），用于绘制标准曲线，所有测定均在室温下进行。

1.3.3 特异性鉴定

配制800 ng/mL的马拉硫磷、乐果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敌敌畏、草甘膦、吡虫啉、倍硫磷溶液，按照AuNPs-适配体比色传感法检测马拉硫磷的步骤，分别进行适配体的特异性鉴定，并取等体积的缓冲液作为阴性对照。

1.3.4 实际样品检测

粉碎并称取5.0 g具有代表性的果蔬样本并加工成均质的匀浆，加入20 mL浓度为10 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液与其混合，然后置于振荡器上剧烈振荡10 min，之后室温下8 000 r/min离心20 min，以除去固体物质。然后使用0.22 μm的微孔滤膜过滤上清液，将过滤后的上清液作为提取液。将马拉硫磷标准品添加到提取液中，制成不同质量浓度（200、400、800 ng/mL）的加标检测液。使用本方法和国标法进行实际样品中马拉硫磷的检测并将检测结果进行对比。

1.3.5 仪器验证

参照国家标准方法（GB 23200.113—2018《植物源性食品中208 种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》）[25]，利用气相色谱-质谱联用法对加标样品进行检测，条件如下：色谱柱温度40 ℃保持1 min，然后以40 ℃/min程序升温至120 ℃，再以5 ℃/min升温至240 ℃，再以12 ℃/min升温至300 ℃，保持6 min，进样量为1 μL，流速为1.0 mL/min。

1.4 数据统计与图表绘制

采用Origin 2021软件进行数据统计及图表绘制，每组实验重复3 次平行实验，取平均值作为实验数据。

2 结果与分析

2.1 AuNPs的表征

制备的AuNPs为颜色鲜艳的酒红色胶体溶液，紫外表征发现其特征吸收峰在518 nm波长处，峰形较为尖锐（图2），这表明制备的AuNPs粒径均一，具有较好的性能。用透射电镜对制备的AuNPs的外观形貌进行表征（图3），可以看出AuNPs呈现统一的圆球形，粒径较为均一，约为10 nm。正常情况下为分散状态（图3A），而在加入NaCl溶液后会发生聚集（图3B）。综上所述，本研究合成的AuNPs在水中呈现胶体状，具有均有的大小和形状，分散性良好，性质稳定[26]。

图2 AuNPs的紫外表征Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum of AuNPs

图3 AuNPs的透射电镜表征Fig.3 Transmission electron microscopic image of AuNPs

2.2 检测体系优化

2.2.1 AuNPs体积的优化

AuNPs是整个检测体系的颜色指示剂，其体积在整个反应体系中的占比直接影响方法的灵敏度，为获得裸眼观察的最佳指示颜色深度，通过向溶液中加入30 μL的马拉硫磷适配体溶液、马拉硫磷标准品溶液和500 mmol/L N a C l 溶液，优化A u N P s 在整个反应体积中的占比（40.0%、50.0%、62.5%、70.0%），结果见图4，当AuNPs体积分数为40%、50%和62.5%时，体系可以由红色变蓝色，但是体积分数为40%和50%时，颜色变化不明显，体积分数为62.5%时，颜色变化较为明显。因此选择AuNPs的体积分数为62.5%，即加入150 μL AuNPs溶液。

图4 AuNPs的体积优化Fig.4 Optimization of volume of AuNPs used

2.2.2 NaCl浓度的优化

AuNPs会在高盐环境下发生聚集，随着NaCl浓度的增加，AuNPs的聚集程度也随之增加，AuNPs的颜色发生明显变化，由酒红色逐渐变为蓝紫色。当NaCl浓度过大时，在没有靶标的情况下AuNPs也可能发生聚集；当NaCl浓度过小时，AuNPs可能只发生部分聚集从而影响试验的结果，因此本研究对NaCl浓度进行优化[27]。在AuNPs的最佳反应体积下（150 μL），用超纯水代替适配体和靶标，然后加入30 μL不同浓度（0、50、200、350、500、650、800、950 mmol/L）的NaCl溶液，充分混匀，静置10 min后观察溶液的颜色并使用紫外分光光度计进行吸光度的测定。

如图5所示，当NaCl浓度低于500 mmol/L时，AuNPs呈红色，表明此时的NaCl浓度较低，无法使AuNPs发生聚集；当NaCl浓度为500 mmol/L时，AuNPs发生聚集，颜色由红色变为蓝色。之后随着NaCl浓度的继续增加，AuNPs的颜色不再发生明显变化。但是单以颜色变化不能够准确判定出AuNPs聚集完成情况，需要根据紫外吸收光谱的变化进行判定。由图5可以看出，随着NaCl浓度增加，AuNPs在518 nm波长处的吸收峰值逐渐变小，并且在620 nm波长处出现了一个新的特征吸收峰，这是因为AuNPs发生聚集导致等离子发生了共振变化，使得AuNPs的特征吸收峰向右发生了偏移。因此，需要根据A620nm/A518nm值判定AuNPs的聚集程度，结果如图6所示，当NaCl浓度为500 mmol/L时，A620nm/A518nm值突然增大，之后随着NaCl浓度的继续增加，不再发生明显变化，因此NaCl的最佳浓度为500 mmol/L。

图5 NaCl的浓度优化Fig.5 Optimization of NaCl concentration

图6 不同NaCl浓度下A620 nm/A518 nm值Fig.6 A620 nm/A518 nm ratio at different NaCl concentrations

2.2.3 适配体浓度的优化

当AuNPs溶液中不存在适配体时，AuNPs在高盐环境下会发生聚集，AuNPs由红色变为蓝紫色；当加入的适配体浓度较低时，通过静电吸附作用，低浓度的适配体可以吸附在AuNPs表面，但因为浓度较低，不能够将AuNPs的表面完全包裹，仍然有一部分AuNPs呈单一分散状态，此时AuNPs溶液会由蓝色变为蓝紫色；当适配体浓度为1 μmol/L时，适配体可以保护AuNPs不发生聚集现象，此时AuNPs溶液呈现酒红色，之后随着适配体浓度的继续增加，不再发生明显变化。如图7所示，当适配体浓度为1 μmol/L时，A620nm/A518nm值也不再随着适配体浓度的增加而改变，说明在500 mmol/L的NaCl浓度下，1 μmol/L的适配体已经将AuNPs的表面完全包裹，使其结构更加稳定，不再受高NaCl浓度的影响发生聚集现象。

图7 不同适配体浓度下A620 nm/A518 nm值Fig.7 A620 nm/A518 nm ratio at different aptamer concentrations

2.2.4 反应时间的优化

AuNPs在高浓度NaCl溶液中的聚集需要一定时间，在达到稳定状态之前，颜色会不断发生变化，与之相应的A518nm也会不断发生变化。为了使检测更为准确，减小误差，需要研究体系颜色从不断发生变化到达到稳定状态所需要的时间。如图8所示，当NaCl浓度为500 mmol/L时，A518nm在10 min之前，随着反应时间的延长吸光度不断降低；而在10 min后，随着反应时间延长，吸光度不再发生明显变化。因此，AuNPs与500 mmol/L的NaCl溶液的最佳反应时间为10 min。

图8 AuNPs与NaCl不同反应时间下A518 nm值Fig.8 Change in A518 nm as a function of reaction time between AuNPs and NaCl

如图9所示，随着AuNPs与适配体孵育时间延长，A518nm也随之增加，在10 min时吸光度达到最大。然后随着时间延长，吸光度开始出现一段下降趋势。这表明时间较短时，适配体还没有完全吸附在AuNPs的表面，存在一部分分散的AuNPs；适配体作为单链DNA序列，反应时间过长时，序列的质量在室温下会有所下降，可能会导致部分AuNPs不再处于聚集状态。综上所述，AuNPs与适配体的最优反应时间为10 min。

图9 AuNPs与适配体不同反应时间下A518 nm值Fig.9 Change in A518 nm as a function of reaction time between AuNPs and aptamer

2.3 灵敏度检测

在最佳的条件下，建立了AuNPs-适配体比色传感法定量检测马拉硫磷的方法，为减弱基质效应影响，采用与实际样品相同的加标条件绘制了基质标准曲线。如图10所示，随着马拉硫磷质量浓度升高，溶液颜色逐渐由红变蓝，在马拉硫磷质量浓度范围为50～1 500 ng/mL时，A620nm/A518nm值与马拉硫磷质量浓度呈线性关系，线性回归方程为Y=0.930 07X＋2.695 75×10-4，R2=0.995，检出限为45.54 ng/mL。在马拉硫磷质量浓度为300 ng/mL时，AuNPs已经开始变色，为防止视觉误差，马拉硫磷目测检出限为400 ng/mL。本方法与其他检测方法的比较如表1所示，国标中规定的生菜和苹果中马拉硫磷的最大残留限量最低为500 ng/mL，本方法的检出限远低于国标限量，且在较大的线性范围内均适用。

表1 文献报道方法与本法检测马拉硫磷的比较Table 1 Comparison of this method and other reported ones for the determination of malathion

图10 不同马拉硫磷质量浓度下A620 nm/A518 nm值Fig.10 A620 nm/A518 nm ratio at different malathion concentrations

2.4 特异性鉴定

本研究选择马拉硫磷、乐果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敌敌畏、草甘膦、吡虫啉、倍硫磷考察方法的特异性，如图11所示，在体系中加入800 ng/mL的马拉硫磷、乐果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敌敌畏、草甘膦、吡虫啉、倍硫磷，除马拉硫磷外，加入其他农药时A620nm/A518nm值较低，与阴性对照大致相同，AuNPs不发生聚集；而加入马拉硫磷时，体系中A620nm/A518nm值较大，AuNPs发生聚集现象。表明本方法对马拉硫磷具有特异性识别能力，且马拉硫磷结构类似物及其他有机磷农药不会影响马拉硫磷残留的特异性检测。

2.5 实际样品检测结果

为验证建立的AuNPs-适配体比色传感法的准确性和可靠性，采用本方法对生菜和苹果样品进行检测。从本地超市购得生菜和苹果样品中未检出马拉硫磷。通过向预处理的样品中添加马拉硫磷标准品制成不同质量浓度（200、400、800 ng/mL）的加标检测液。使用本方法进行检测，每个样品重复测定3 次。如表2所示，基于AuNPs-适配体的比色传感法检测马拉硫磷的加标回收率范围分别为98.24%～100.91%和99.48%～101.29%，相对标准偏差分别为0.2%～2.2%和0.2%～2.8%。上述结果表明，基于适配体建立的AuNPs-适配体比色传感法具有良好的准确性和可靠性。本方法可用于生菜和苹果中马拉硫磷的快速筛查和现场检测。

表2 马拉硫磷在生菜和苹果中的加标回收结果（本方法）Table 2 Recoveries of malathion from spiked lettuce and apple samples using this method

2.6 方法验证结果

国标法检测结果如表3所示，将本方法的检测结果与国标法的结果进行对比（图12），结果显示两者的准确度一致，生菜样品和苹果样品的R2均为0.999，证实了本方法的可靠性。

表3 马拉硫磷在生菜和苹果中的加标回收结果（国标法）Table 3 Recoveries of malathion from spiked lettuce and apple samples using the national standard method

图12 本方法和国标法的加标回收结果对比Fig.12 Comparison of recoveries of this method with those of the national standard method

3 结 论

以AuNPs为指示剂，马拉硫磷适配体作为识别元件，建立了AuNPs-适配体比色传感法。通过优化溶液浓度，最后得到NaCl最适浓度为500 mmol/L，适配体浓度为1 μmol/L。通过优化孵育时间，最终得到的NaCl与AuNPs最佳反应时间为10 min，马拉硫磷适配体与AuNPs最佳反应时间为10 min。本方法在马拉硫磷质量浓度为50～1 500 ng/mL范围内呈现良好的线性关系，线性相关系数R2=0.995，根据计算得到本方法检出限为45.54 ng/mL，

目测检出限为400 ng/mL。本方法简单快速，易于进行定性和定量分析，具有优异的灵敏性、特异性和准确性。经验证，本方法在实际加标样品中的检测结果与国标法的检测结果高度一致，是一种可行的快速检测食品中马拉硫磷残留的高效方法，可为其他农药的现场快速筛查方法研究提供参考。