基于Illumina MiSeq测序技术探究冷藏菊黄东方鲀菌群演替规律

曾 鹭，刘淑集，陈晓婷，林河通,*，刘智禹,*

（1.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2.福建水产研究所 国家海水鱼类加工技术研发中心，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013）

菊黄东方鲀（Takifugu flavidus）属鲀形目、鲀科、东方鲀属。其肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，蛋白质含量高，同时富含多种必需氨基酸和钾、磷、钙等多种矿物质[1-2]。菊黄东方鲀养殖区域主要分布在福建、山东、江苏、广东等沿海地区，且养殖的菊黄东方鲀需在经备案的加工厂处理后，以鲜品（0～4 ℃冷藏）或冻品（-18 ℃贮藏）的形式进入市场流通[3]。然而，由于菊黄东方鲀体内蛋白质和水分含量较高，容易受到外源微生物的侵染，少部分微生物在鱼体内不断繁殖，迅速生长成为鱼体的特定腐败菌[4-5]，这些腐败菌往往具有很强的致腐性[6]，会导致鱼肉组织结构分解，氧化酸败的速度加快，进而产生硫化物、醛、胺、有机酸等有害物质，严重影响鱼肉的品质和贮藏期[7-8]。鉴定并抑制引起菊黄东方鲀冷藏期间腐败变质的微生物菌群，是保持鱼肉品质和延长货架期的关键。

传统分离培养技术鉴定菌种，需要多次纯化培养，分离得到单菌株后，再由进一步的生理生化实验鉴定得出结果。但是在培养过程中，只采用一种培养基进行培养时，不能或很难同时培养出所有的微生物，有些微生物需要在选择性培养基才能培养，所以如果想要较准确地培育出大部分微生物，需要采用多种不同的培养基同时进行培养，增加了许多工作量。高通量测序技术作为一种免培养的分子生物学技术，通过提取样品中微生物的DNA或RNA进行生物信息学分析，从而得到具体的群落多样性信息[9-10]。它具有数据产出快速、通量高且分析全面等特点，能详细反映样本中微生物的菌落情况[11]。其中16S rDNA扩增子测序是指通过对V4区或V3～V4区序列进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增再测序的方法，常被应用于研究样品中微生物群落组成结构，目前已被广泛应用于土壤、根际、环境、动物肠道以及食品等领域的研究中[12-15]，极大改变了人们对微生物生态学的认识。高通量测序技术在河鲀中的应用主要在于探究河鲀肠道微生物的菌群结构分布[16-19]，而针对冷藏过程中河鲀微生物菌群组成和特定腐败菌的研究，仅李萌等[20]研究表明了导致冷藏红鳍东方鲀腐败变质的关键菌主要是荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescent）、莓实假单胞菌（P.fragi）、热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）和乡间布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）。然而，不同品种、不同贮藏环境都会使腐败菌的种类发生改变[21-24]，有关菊黄东方鲀在冷藏条件下表面微生物变化的研究还鲜见相关报道。

因此，本研究以菊黄东方鲀冷藏过程的菌落总数（total viable count，TVC）和挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值测定结果为依据，确定贮藏终点，通过高通量测序技术分析养殖菊花东方鲀鱼肉在冷藏前期（0～3 d）、中期（3～6 d）、后期（6～15 d）的菌相演替变化规律，最终确定菊黄东方鲀冷藏期间的优势腐败菌及其致腐能力，以期为后期靶向抑制及品质控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

养殖菊黄东方鲀购于福建省漳州市漳浦县，养殖周期为2 a，体质量约（309.41±72.72）g，体长约（22.52±1.14）cm。参照DB/T 2042—2021《养殖菊黄东方鲀加工技术规范》进行宰杀，去内脏、鱼皮、鱼头和鱼鳍，随后用冰水冲洗直至无污物无血水，沥干，于（0±2）℃冰箱保藏。

甘油、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、无水碳酸钾、硼酸、水溶性胶、0.01 mol/L盐酸标准滴定溶液、甲基红、溴甲酚绿 国药集团化学试剂有限公司；LB营养琼脂、0.85%无菌生理盐水管 青岛海博生物技术有限公司；生理盐水 广东环凯微生物科技有限公司；TVC测试片 广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Hieff®Robust PCR Master Mix、Hieff NGSTMDNA Selection Beads 上海Yeasen公司；pMD18-T Vector连接试剂盒 日本TaKaRa公司；Qubit3.0 DNA检测试剂盒 美国Life公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 美国Omega公司。

1.2 仪器与设备

Pico-21台式离心机 德国Thermo Fisher公司；GL-88B旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；TND03-H-H混匀型干式恒温器 深圳拓能达科技有限公司；DYY-6C电泳仪电源、DYCZ-21电泳槽 北京市六一仪器厂；FR-1000凝胶成像系统 上海复日科技有限公司；Q32866Qubit®3.0荧光计 美国Invitrogen公司；ETC 811 PCR仪 北京东胜创新生物科技有限公司；3730XL测序仪 美国Applied Biosystems公司；DHP-9162恒温培养箱 太仓市科教器材厂；TH2-C恒温摇床 太仓市实验设备厂；HC-2518R冷冻高速离心机英国BBI公司。

1.3 方法

1.3.1 TVC测定

参考GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》。取1、3、5、7、9、11 d的鱼肉样品25 g，绞碎后加入225 g生理盐水，振荡混匀，静置3 min，取上清液，并进行梯度稀释，制成不同浓度的菌悬液。分别吸取1 mL菌悬液于TVC测试片中，30 ℃培养48 h。

1.3.2 TVB-N值的测定

参考GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》中第三法微量扩散法进行测定。取1、3、5、7、9、11 d的鱼肉样品20 g，浸泡0.5 h后，取上清液进行测定。

1.3.3 16S rDNA高通量测序

1.3.3.1 实验材料及预处理

取冷藏解冻后菊黄东方鲀的背部肌肉分别于0、3、6、9、12、15 d进行采样，并依次编号为R0、R3、R6、R9、R12、R15，后测序。

1.3.3.2 细菌总DNA的提取

参考李凯凯等[25]的方法，将绞碎后的样品加入适量钢珠和裂解液，放入2 mL离心管中，使用破碎仪破碎后用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取试剂盒进行提取。

1.3.3.3 PCR扩增

引物序列：341F-CCTACGGGNGGCWGCAG；805R-GACTACHVGGGTATCTAATCC。第1轮扩增：反应体系（30 μL）为2×Hieff®Robust PCR Master Mix 15 μL、Bar-PCR Primer F 1 μL、Primer R 1 μL、PCR products 10～20 ng、H2O 9～12 μL；第2轮扩增：反应体系（30 μL）：2×Hieff®Robust PCR Master Mix 15 μL、Primer F 1 μL、Index-PCR Primer R 1 μL、PCR products 20～30 ng、H2O 9～12 μL。

1.3.4 优势腐败菌的分离鉴定

参考孟凌云等[26]的方法并稍作修改，将冷藏后期的样品搅碎，加入无菌水稀释到一定梯度，随后用接种环划线到固体培养基中，30 ℃培养36 h，挑取不同形态的单菌落（共10 株）于LB液体培养基中扩大培养，划线纯化3 次后，菌液中加入20%的甘油进行保种，置于-20 ℃中保藏。菌种进行测序、鉴定。

1.3.5 优势腐败菌致腐能力的比较

参考赵宏强等[27]的方法对不同腐败菌致腐能力进行分析，并根据1.3.1、1.3.2节方法分别检测冷藏初期与末期时单位数量腐败菌产生的TVC和TVB-N值，以腐败代谢产物产量因子作为评估腐败能力的指标，按下式计算：

式中：TN1、TN0分别为末期和初期TVB-N值/（mg/100 g）；TC1、TC0分别为末期和初期TVC/（CFU/g）。

1.4 数据处理

利用mothur进行rarefaction分析，应用R软件制作曲线图。采用Excel 2007进行数据统计及处理，SPSS Statistics 21进行显著性分析，Origin 8.5绘制曲线。采用MEGA 11.0构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菊黄东方鲀冷藏期间TVC和TVB-N值变化情况

TVC和TVB-N与水产品鲜度密切相关，常用来反映水产品的腐败情况。有研究表明，可食用生鱼肉的TVC上限值为5.00（lg（CFU/g））[28]，Zhou Ran等[29]在4 ℃冷藏条件下测得贮藏4 d的暗纹东方鲀TVC为5.07（lg（CFU/g）），而经过保鲜处理的河鲀鱼肉则是到6 d TVC才超过5.00（lg（CFU/g）），河鲀的货架期延长了2 d。如图1所示，在贮藏过程中冷藏菊黄东方鲀的TVC逐渐增加，5 d达到了4.93（lg（CFU/g）），接近生鱼肉可食用上限值，而在11 d TVC升至7.32（lg（CFU/g）），超过食品中微生物的最高限值7.00（lg（CFU/g））[30]，因此可以说明菊黄东方鲀在冷藏情况下能贮藏5 d，冷藏到11 d已经腐败。

图1 菊黄东方鲀冷藏过程中TVC的变化Fig.1 Changes in total viable count of T. flavidus during cold storage

根据GB/T 18108—2019《鲜海水鱼通则》规定，海水鱼TVB-N值一级鲜度界限值＜15.00 mg/100 g[31]，但是对于不同品种的鱼，其TVB-N值的可接受上限值不同，如鳕鱼鱼肉中TVB-N值的可接受上限为60 mg/100 g，银鲤和黑鲈则分别为35.00 mg/100 g和10.00 mg/100 g[32-34]，而根据马妍等[35]的研究结果，河鲀TVB-N值的上限为12～13 mg/100 g。如图2所示，随着冷藏时间的延长，微生物数量不断增加，促进了蛋白质降解，使得菊黄东方鲀的TVB-N值从7 d以后迅速增加，到9 d TVB-N值增加到12.16 mg/100 g，达到上限值；到11 d TVB-N值已超过可接受上限值。

图2 菊黄东方鲀冷藏过程中TVB-N值的变化Fig.2 Changes in total volatile basic nitrogen content of T. flavidus during cold storage

TVC、TVB-N值、感官评价常作为预测货架期的指标，但是感官评价过于主观，而TVB-N值的变化是由于微生物的繁殖，一般常用TVC预测货架期。如周慧等[36]测定虹鳟鱼在0 ℃贮藏条件下，6 d TVC为5.59（lg（CFU/g）），超过生鱼肉可食用上限值，而15 d的TVB-N值为18.34 mg/100 g，未达到腐败标准（20.00 mg/100 g），所以采用TVC确定虹鳟鱼0 ℃贮藏条件下的货架期终点为5 d。根据测定结果，菊黄东方鲀5 d的TVC接近可食用上限，TVB-N值符合一级鲜度界标准，因此确定菊黄东方鲀在0 ℃冷藏条件下的货架期终点为5 d。

2.2 16S rDNA高通量测序结果

2.2.1 有效序列长度

通过细菌V3～V4区的测序，对各样本数据进行质控过滤，得到有效数据。从河鲀鱼肉共检出70.80多万条有效序列，平均长度在380～398 碱基对，在相似度97%的水平上进行归类操作，发现样品在种属水平上分类，共聚成2 026 个可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。

稀释曲线常被用来评估样品测序数据量是否合理，以从样本中随机抽取的序列数为横坐标，与之对应的OTU数为纵坐标，并绘制曲线，曲线的变化趋势可以间接反映物种丰度。Shannon曲线反映了样品中微生物的多样性，横坐标为测序过程读取的样本数，随着样本数的增加，曲线的趋势逐渐平坦时，说明此时的测序数据量可以充分反映样品中绝大多数的微生物信息[37]。如图3、4所示，当测序量低于10 000时，稀释曲线呈现显著上升趋势，当测序数量逐渐增加达到40 000时，曲线已趋于平缓，且Shannon曲线已经完全达到饱和状态，说明细菌多样性已经得到充分展示，不会再发生变化，本研究测序量满足后续生物信息学分析要求。

图3 不同冷藏时间菊黄东方鲀样品稀释曲线Fig.3 Rarefaction curves of bacterial community in refrigerated T. flavidus at different storage times

图4 不同冷藏时间菊黄东方鲀样品Shannon曲线Fig.4 Shannon curves of bacterial community in refrigerated T. flavidus at different storage times

2.2.2 多样性分析

α多样性指数主要包括Chao1、Shannon和Simpson指数，前一个指数可以反映微生物群落分布的相对丰度，后两者则反映了群落分布的多样性。覆盖率用来检验本次测序结果能否代表样本的真实情况[38]。经检测，样品覆盖率都达到了99%以上，表示大部分序列都已被检出，说明本研究能够用于样品微生物多样性分析。

如表1所示，河鲀鱼肉的Chao1指数在第3天达到最大值，随后逐渐减小，说明河鲀冷藏3 d细菌群落的OTU数目最多，菌群丰度最大；Simpson指数越小，菌群多样性越高，鱼肉在第3天的Simpson指数为0.20，此时菌群多样性最高，随后降低，这与和Huang Wenbo等[39]研究结果相似，说明随着冷藏时间的延长，环境中氧含量逐渐降低，蛋白质等大分子被分解，为优势物种的快速生长提供条件，同时抑制了部分微生物的生长，导致后期多样性和丰富度下降。

表1 样本α多样性指数统计Table 1 Statistics of α diversity indexes of samples

2.2.3 菌群结构分析

菌群变化柱状图可以直观展示样本随着冷藏时间的延长，微生物物种组成及比例的变化情况。通过对比数据库，对OTU进行物种分类，并分别在门、纲、目、科、属水平作优势物种相对丰度柱状图（丰度占比小于1%的物种归类为others）。

2.2.3.1 菌群门、纲水平分布

养殖菊黄东方鲀在0 ℃冷藏过程中鱼肉的菌群变化丰富，在门水平上检测到占比较大的菌门，分别有变形菌门（Proteobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria_Chloroplast）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）等，在纲水平上检测到了变形菌纲（Gammaproteobacteria）、叶 绿 体 纲（ C h l o r o p l a s t ） 、α- 变 形 杆 菌 纲（Alphaproteobacteria）和梭菌纲（Clostridia）等。从图5a可以看出，在冷藏前期，蓝细菌门在鱼肉微生物菌群中的占比最大，达到56.60%，其次为未分类的细菌，所占比例为9.31%。随着冷藏时间的延长，蓝细菌门比例显著降低，由46.51%减少至1.22%，而变形菌门的比例则显著增长，从15.90%增长至96.50%（15 d），冷藏期间最高占比为99.28%，成为菊黄东方鲀冷藏期间的优势菌门。

图5 样本微生物在门水平（a）和纲水平（b）上相对丰度分布Fig.5 Relative abundance of bacteria in samples at the phylum (a) and class level (b)

整个贮藏过程纲水平的相对丰度分布情况与门水平相似，但是在纲水平中出现了更多的细分，变形菌门主要分为α-变形菌纲、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），厚壁菌门主要细分为梭菌纲和芽孢杆菌纲（Bacilli），拟杆菌门包括黄杆菌纲（Flavobacteriia）和鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia）（图5b）。

2.2.3.2 菌群属水平分布

菊黄东方鲀冷藏过程中，在属水平上的微生物菌群变化共有10 个主要的菌属，分别为假单胞菌属（Pseudomonas）、链霉菌属（Streptophyta）、希瓦氏菌属（Shewanella）、梭菌属（Clostridium_sensu_stricto）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、黄杆菌属（Flavobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、苯基杆菌属（P h e n y l o b a c t e r i u m）、鞘氨醇菌属（Chitinophaga）、食酸菌属（Acidovorax）（图6）。

图6 样本微生物在属水平上相对丰度分布Fig.6 Relative abundance of bacteria in samples at the genus level

随着冷藏时间的延长，鱼肉中主要菌属由9 种增加至12 种，随后逐渐递减为假单胞菌属、希瓦氏菌属，作为水产品中常见的优势腐败菌，经常在腐败过程中发挥着重要作用[40]。在0 d，优势腐败菌属（相对丰度＞1%）有假单胞菌属、链霉菌属、希瓦氏菌属、梭菌属、鞘氨醇单胞菌和黄杆菌属等，3 d增加了不动杆菌属、苯基杆鞘氨醇菌属和食酸菌属；6 d仅存在假单胞菌属、链霉菌属、希瓦氏菌属和梭菌属；9～15 d假单胞菌属和希瓦氏菌属占比分别超过86.40%和12.24%，成为最优菌属。

假单胞菌属和希瓦氏菌属都属于革兰氏阴性菌，具有很强的蛋白分解能力且能生存在低温环境下，经常在有氧冷藏的水产品贮藏末期中被检出[41-42]。假单胞菌属的腐败机制主要是使水产品产生小分子醛酮及产生异味的挥发性代谢物。希瓦氏菌属则是可以产生大量硫化物，并且黏附在水产品表面形成生物被膜，分解蛋白，进一步引起腐败变质[43-47]。目前，已经检测到石斑鱼、大黄鱼、三文鱼等在冷藏过程中产生的优势腐败菌多为假单胞菌属或希瓦氏菌属[48-50]。

总体而言，在冷藏期间变化较大的菌属主要有假单胞菌属、链霉菌属、希瓦氏菌属，其中链霉菌属仅在前6 d占比较大，而9 d后比例迅速下降直至消失；希瓦氏菌属在6 d开始迅速增长，在第9天达到最大比例，随后逐渐减少；假单胞菌属冷藏初期的比例较低，在后期占据比例超过86.40%，成为优势腐败菌。综上表明，菊黄东方鲀在0 ℃冷藏过程中存在着复杂的菌群变化，且随着冷藏时间的延长，腐败微生物种类更趋于集中单一化，在冷藏末期分离纯化得到的优势腐败菌为假单胞菌属和希瓦氏菌属。

2.3 优势腐败菌的分离、鉴定

从冷藏菊黄东方鲀末期共筛选出10 株菌，分别命名为J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7、J8、J9、J10，其菌落形态大多表现为光滑、边缘整齐、隆起、易挑起，但是菌落大小不一，颜色有白色和淡黄色的区别。以1.70%琼脂糖凝胶电泳检测菌落纯度，如图7所示，各菌株均出现了单一条带，显示PCR扩增较成功，可以用于后期测序。

图7 高通量测序法下V3～V4可变区DNA电泳图Fig.7 Electropherogram of PCR-amplified V3–V4 variable region

所得序列进行BLAST分析，选取同源性超过99%的菌株序列构建系统进化树。图8所示即为最高相似度菌种名称及其登录号，10 株菌株分别是波罗的海希瓦氏菌（S.baltica）、哈夫尼希瓦氏菌（S.hafniensis）、希瓦氏菌属（S h e w a n e l l as p.）、液化沙雷氏菌（S.liquefaciens）、维氏气单胞菌（A.veronii）、P.extremorientalis、产氮假单胞菌（P.azotoformans）、荧光假单胞菌（P.f l u o re s c e n s）、杰氏假单胞菌（P.jessenii）、隆德假单胞菌（P.lundensis）。其中希瓦氏菌和假单胞菌的比例比较高，符合菌相变化规律。

图8 基于16S rDNA序列的同源性菌株系统发育树Fig.8 Phylogenetic tree of strains based on 16S rDNA sequences

2.4 优势腐败菌的致腐能力

不同腐败菌的致腐能力不同，通过产量因子可以定量表示各种腐败菌的致腐能力大小，产量因子数值越大，则腐败能力越强。如表2所示，荧光假单胞菌和产氮假单胞菌的产量因子分别为1.05×10-9、3.05×10-10mg/CFU，明显高于希瓦氏菌属，致腐能力更强。菊黄东方鲀冷藏期间产生的腐败菌的致腐能力由高到低依次为荧光假单胞菌、产氮假单胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、波罗的海希瓦氏菌。该实验结果与倪荣[51]和于淑池[52]等的研究结果相似。

表2 不同腐败菌腐败能力的分析Table 2 Spoilage capacity of different spoilage bacteria isolated from T. flavidus

3 结 论

根据0 ℃冷藏过程中菊黄东方鲀鱼肉的TVC和TVB-N值测定结果，得出其冷藏终点为5 d。利用高通量测序技术对菊黄东方鲀冷藏期间鱼肉的菌相变化进行研究，发现鱼肉在冷藏初期菌群多样性指数高，而冷藏末期菌属较为单一，假单胞菌属和希瓦氏菌属占比较大，故将其判定为菊黄东方鲀冷藏期间的优势腐败菌，其中假单胞菌属比例远高于希瓦氏菌属，是导致鱼体腐败的主要腐败菌。

通过传统培养基法对菊黄东方鲀冷藏末期的腐败菌进行分离纯化，共筛选出10 株菌株，经16S rDNA测序技术鉴定为假单胞菌属和希瓦氏菌属，符合菌相变化规律，进而验证高通量测序结果的准确性，并对常见几种菌进行致腐能力分析，发现荧光假单胞菌的致腐能力最强，产氮假单胞菌次之，最弱的哈夫尼希瓦氏菌和波罗的海希瓦氏菌，二者致腐能力相当。本研究旨在为靶向抑菌、延长菊黄东方鲀的货架期提供理论依据。