实时荧光核酸恒温扩增试验对肺炎支原体感染的诊断价值

孙天文, 刘思辰, 杨 柯

(周口市中心医院检验科,河南 周口 466099)

肺炎支原体肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)可在任何年龄的人群中引起感染,是儿童和青壮年社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)的主要病原体之一[1]。其临床症状包括发热、咳嗽、喉咙痛及鼻炎,偶尔也有头痛。MPP也会引起一些呼吸道疾病,如肺脓肿、闭塞性细支气管炎、支气管扩张、胸腔积液、肺栓塞、呼吸窘迫综合征及一些肺外表现(如脑炎等),严重影响患者身体健康,因此需要尽早对MPP进行诊断和治疗。然而,由于MPP感染的临床征象及影像学不具有特异性,对MPP感染患儿的早期诊断仍存在困难[2]。

目前对于MPP的实验室检查方法较多,常用的有MPP培养、血清学抗体检测、间接免疫荧光法、MPP核酸检测技术及实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)。由于MPP培养周期长且容易出现假阴性,该方法的早期诊断价值低。MPP血清学抗体检测也存在一定缺陷,一方面血清检测属于有创操作,对于患儿特别是低龄儿童存在困难。另一方面血清学的抗体检测需要宿主产生抗体,需要约1周时间,因此容易出现假阴性的结果,而双份血清检测耗时长,不适用于早期诊断。间接免疫荧光法也是近年来常用的一种方法,但其易受患儿年龄、病程、自身抗体等影响,也易因包被抗原不足出现假阴性[3]。MPP的核酸检测技术依赖于DNA靶标,因此无法辨别“活菌”与“死菌”,容易出现假阳性结果[4]。SAT作为新一代“活菌”检测技术,直接检测“活菌”的RNA,有效区分“活菌”与“死菌”,具有高灵敏度、高特异性、反应稳定等众多优点[5]。SAT技术目前已被用于多种病原体的检测,包括解脲脲原体[6-7]、金黄色葡萄球菌[8]、肺结核分枝杆菌[9-10]等。目前对于MPP-SAT的报道不多,本研究旨在分析SAT技术与间接免疫荧光法在诊断儿童MPP中的价值,为更准确地选择儿童MPP感染的检测方法提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料 选取2020年4月—2021年10月在周口市中心医院诊治的382例CAP患儿的临床资料进行回顾性研究,患儿的诊断均参照《儿童社区获得性肺炎管理指南》[11]。排除标准:①病历资料不全。 ② 患有先天性免疫缺陷。③患有肺结核。④对阿奇霉素药物过敏者。本研究经医院伦理委员会审批通过,且患儿家属均签署知情同意书。MPP感染患儿诊断标准:MPP感染患儿的诊断标准参照《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识(2015年版)》[12],确诊为CAP的基础上满足以下任意一项:① 入院24 h内初测血清MPP抗体阳性(单次血清抗体滴度≥1:160)。②病程处于恢复期时(10 d)复测血清MPP抗体呈4倍或4倍以上。其中男244例,女138例;年龄2个月～10岁1个月(4.92±4.06)岁。本研究以血清学抗体(IgM+IgG)诊断MPP感染的结果为参考,在382例儿童CAP患儿中,入院时初测血清MPP抗体阳性(单次血清抗体滴度≥1:160)的患儿85例,初测阴性的患儿在病程处于恢复期时(10 d)进行血清复测,复测血清MPP抗体呈4倍或4倍以上升高的患儿40例,两次检测共诊断MPP感染患儿125例,其中男69例,女56例;年龄≤1岁患儿5例,年龄>1岁患儿120例,年龄0～12(4.59±3.31)岁;病程2～21(5.94±6.76)d;患儿合并病毒感染12例,合并细菌感染19例;入院前曾有大环内酯类药物治疗史23例,无大环内酯类药物治疗史102例。

1.2 检查方法

1.2.1 颗粒凝集法检测MPP-Ab滴度 于入院24 h内采集患儿静脉血,分离血清,采用珠海丽珠试剂公司的SERODIA-Myco Ⅱ试剂盒严格按照说明书步骤进行混合抗体滴度检测。初测阴性的患儿于病程处于恢复期时(10 d)复测血清MPP抗体。

1.2.2 MPP-SAT检测方法 采用上海仁度生物科技有限公司的MPP核酸检测试剂盒进行检测。在入院24 h内采集患儿的咽部分泌物,将拭子头放于9 g·L-1盐水中浸泡后贴壁挤干,加入等量裂解液获得待测样本。加入内标后,采用磁珠法提取待测核酸RNA进行扩增。体系为40 μL,42 ℃,1 min,共进行40个循环。设置HEX荧光通道为内标检测通道,FAM荧光通道为样本检测通道。荧光信号每分钟收集1次,共40次,绘制扩增曲线。dt ≤ 35 min 为阳性,>40 min为阴性;35～40 min 的样本重新进行检测。

1.2.3 间接免疫荧光法 于入院24 h内采集患儿静脉血,分离血清,采用病原体IgM抗体检测试剂盒严格按照说明书步骤检测MPP-IgM抗体,结果判定严格按照说明书。

2 结果

2.1 MPP-SAT诊断价值分析 入院24 h内行MPP-SAT检测,阳性结果共116例,其中属于血清学抗体诊断阳性患儿110例,不属于血清学抗体诊断阳性患儿6例。见表1。间接免疫荧光法阳性结果共88例,其中属于血清学抗体诊断阳性患儿79例,不属于血清学抗体诊断阳性患儿9例。见表2。由以上结果可知,MPP-SAT诊断儿童MPP的敏感度为88.00%(110/125)、特异度为97.67%(251/257)、阳性预测值为94.83%(110/116)、阴性预测值为94.36%(251/266)、MPP-SAT与血清学抗体检测一致性Kappa值为0.873。间接免疫荧光法诊断儿童MPP的敏感度为63.20%(79/125)、特异度为96.50%(248/257)、阳性预测值为89.77%(79/88)、阴性预测值为84.35%(248/294),间接免疫荧光法与血清学抗体检测一致性Kappa值为0.646。见表3。

表1 SAT与血清学抗体检测MPP感染的效果比较

表2 间接免疫荧光法与血清学抗体检测MPP感染的效果比较

表3 SAT与间接免疫荧光法对MPP感染的诊断效能分析

2.2 影响MPP-SAT检测阳性率的相关特征分析 采用卡方检验分析了患儿性别、年龄、病程及大环内酯类药物治疗史对MPP-SAT检测阳性率的影响,结果表明患儿病程及大环内酯类药物治疗史对MPP-SAT的检测阳性率有显著影响(P<0.05);病程<7 d院外无大环内酯类药物治疗史的患儿与病程≥7 d院外有大环内酯类药物治疗史的患儿比较,MPP-SAT检测阳性率显著增加。患儿性别及年龄对MPP-SAT的检测阳性率无显著影响(P>0.05)。见表4。

表4 影响MPP-SAT检测阳性率的相关特征分析[n(%)]

2.3 MPP-SAT检测阳性率影响因素的多因素logistic回归分析 为排除混杂因素的影响,将上述对MPP-SAT检测阳性率有显著影响的特征(病程及大环内酯类药物治疗史)进行多因素logistic回归分析,结果表明病程(≥7 d)及有大环内酯类药物治疗史均为MPP-SAT检测阳性率的独立影响因素(P<0.05)。见表5。

表5 MPP感染患儿SAT检测阳性率影响因素的多因素logistic回归分析

3 讨论

MPP感染在临床症状上难以与其他病原体感染区分,从影像学上也不具备特异性,因此MPP感染患儿的早期诊断仍存在困难[2]。而疾病的误诊或漏诊容易导致病情进展,严重时可危及生命,因而急需寻找一种准确性和特异性高的MPP早期诊断方法[13]。目前单一的MPP检测方法缺乏可靠性,多方法的联合检测时间长,经济成本高。目前SAT作为新一代“活菌”检测技术,以病原体特异性RNA 为扩增靶标,直接检测“活菌”的RNA,而在“死菌”内几乎检测不到RNA,因此可有效区分“活菌”与“死菌”,具有高灵敏度和高特异性等优点[5,14],且其对于“活菌”的辨别使其能够实时反映机体内支原体感染状态,不易出现假阳性的结果。SAT技术目前已被用于多种病原体的检测,而对于MPP的检测报道较少,本研究以血清学抗体检测结果为参考,探讨了SAT与间接免疫荧光法在诊断儿童MPP中的价值。

本研究结果发现,SAT检测MPP的敏感度高达88.00%,特异度为97.67%,与血清学抗体检测一致性Kappa值为0.873;而间接免疫荧光法的敏感度为63.20%,特异度为96.50%,与血清学抗体检测一致性Kappa值为0.646;SAT法的敏感度、特异度和Kappa值均高于间接免疫荧光法。通过卡方检验分析影响MPP-SAT检测阳性率的因素发现,病程及大环内酯类药物治疗史对MPP-SAT检测阳性率有显著影响,而年龄及性别对MPP-SAT检测阳性率无显著影响。同时,多因素logistic回归分析表明病程及大环内酯类药物治疗史均为MPP-SAT检测阳性率的独立影响因素。这可能是由于患儿病程较长时自身免疫等因素导致病原体活性降低,同时病原体载量随着病程增加也有所降低,病原体RNA被裂解因而不容易被SAT检测。患儿服用大环内酯类药物治疗后,机体病原体被部分清除,同样会导致病原体RNA被裂解而不容易被SAT检测。

实验室血清学抗体检测是目前MPP感染常用的方法之一,但其有两大缺点:一是早期诊断容易出现假阴性,这是由于MPP感染后机体大约在1周后才会产生抗体,而在入院24 h内单份血清检测时有时由于血清抗体浓度不够而呈现假阴性,需要在恢复期进行复测,难以达到早期诊断的目的[4]。二是年龄较小的婴幼儿由于自身免疫功能发育并不完善,尚不能产生大量抗体,因此也容易出现假阴性的情况[15-16]。而本研究结果显示,SAT检测的阳性率与年龄无关,提示对于年龄小的患儿,更适合采用SAT法检测MPP感染。此外,本研究结果也显示,病程较短患儿的MPP-SAT检测阳性率较病程较长患儿高,提示对于病程短的患儿,更适合采用SAT检测MPP感染,也进一步说明了SAT用于MPP感染早期诊断的优势。同时,从SAT与间接免疫荧光法诊断MPP感染的敏感度和特异度来看,SAT在诊断MPP感染也优于间接免疫荧光法。

综上所述,SAT以病原体RNA作为直接的靶标,在MPP感染的早期诊断方面呈现出显著优势,临床上可采用SAT辅助进行MPP感染的早期诊断。同时,由于病程和大环内酯类药物治疗史对SAT检测结果的影响,临床使用时应在病程早期及无大环内酯类药物治疗史的患儿中进行检测。