萌发对藜麦蛋白质结构与功能特性的影响

郭思倩, 杨肇兴, 姚 洋, 吐鲁洪·托乎提, 李梦阳, 李梦卿, 杜双奎,2

(西北农林科技大学食品科学与工程学院1,杨凌 712100) (粮油功能化加工陕西省高校工程研究中心2,杨凌 712100)

藜麦(ChenopodiumquinoaWilld),又称南美藜、印第安麦、奎藜等,最早发现于南美洲的安第斯山脉,是当地居民的主食。近几年,藜麦因其农业潜力和营养特性吸引全球学者的关注。藜麦蛋白质质量分数高达12%～23%,且富含人体生长所需的9种必需氨基酸[1, 2],其精氨酸、蛋氨酸、赖氨酸含量高于小麦[3]、燕麦[4]、荞麦[5]等谷物。藜麦蛋白属于完全蛋白质,其氨基酸比例与联合国粮食与农业组织(FAO)提出的理想比例接近,被公认为是唯一一种可提供人体所需全部营养物质的粮食单作物[6]。藜麦蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成,还含有较多的谷蛋白[7];其中清蛋白具有较好的溶解度、起泡性、乳化特性和抗氧化活性;球蛋白因其二硫键和特有的球状结构,具有良好的凝胶能力,但溶解性较差[8]。

藜麦在食用前通常需要进行加工,用挤压、膨化、压片等方式将其制成理想的商品[9]。近期有越来越多学者提出应通过减少剧烈的热加工和机械过程来保持谷物优良的营养特性[10]。萌发因低成本、低耗能、成品风味多样化而被视为理想的谷物加工方法已并被广泛应用[11]。此外,有学者将萌发应用于豆干制品加工,发现经过萌发处理,大豆中的蛋白质、维生素C、大豆异黄酮等营养物质含量显著增加,豆干的感官品质得到明显改善[12]。高道叶[13]采用萌发的方式、利用冷水蒸汽提高发芽罐中的湿度,解决了传统浸泡工艺制取发芽糙米过程爆腰率过高的问题,有效提升其食用品质。将荞麦[14]、青稞[15]萌发处理可制得富含γ-氨基丁酸的谷物粉,提升其营养价值。可见萌发在食品工业中具有广泛的应用价值。

籽粒萌发时,储藏蛋白会在蛋白酶的催化作用下分解成氨基酸或小分子质量多肽,使其具有更好的生物效用[16]。与传统的物理、化学及酶法改性相比,萌发具有安全性、环保、费用低廉、易处理等优点,是一种理想的水解和合成新的蛋白质(释放小分子肽一起合成新的蛋白质)的方式[11,17,18]。目前国内外关于萌发对藜麦蛋白质的影响多数停留在藜麦总蛋白含量、蛋白质组分含量以及氨基酸含量动态变化的研究上,涉及萌发对蛋白质结构的影响研究较少,萌发对蛋白质结构和功能特性的影响有待进一步探讨。为此,研究以甘肃白藜麦为原料,对其进行0～72 h的萌发处理,探讨萌发过程中藜麦蛋白质功能特性及结构特性的变化,以期通过萌发提高藜麦蛋白质的利用率,改善其营养价值和加工特性,为其在食品加工领域的应用提供指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

白藜麦原粮产自甘肃;大豆油为一级大豆油(900 mL);SDS-PAGE预制胶、蛋白质Marker、考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液;氢氧化钠、盐酸、SDS、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠等均为分析纯;溴化钾为光谱纯。

1.2 实验仪器与设备

食品级PP加密格育苗盘,XHF-X型高速分散器,LGJ-10C型冷冻干燥机,SC-2546型低速离心机,KDC-40低速离心机,L-530低速离心机,PB-10酸度计,BSA223S型电子天平,FA2004C型电子天平,FW100型高速粉碎机,UV-1200型紫外可见分光光度计,Ls55型荧光分光光度计,Q2000型差示扫描量热仪,Vetex-70型傅里叶变换红外光谱仪,Power pac HC型电泳仪,GE1DOC XR+型凝胶成像系统。

1.3 实验方法

1.3.1 藜麦萌发实验

将新鲜藜麦挑拣、除杂后,清洗浸泡3 h,置于方形育苗盘中,于室内通风处萌发,实验于3月开展,室内平均温度为20 ℃,每12 h用蒸馏水淋洗1次,在萌发0、24、48、72 h取样,同时采用5点法取样测定藜麦幼芽的长度,结果如表1。样品于50 ℃干燥,粉碎、过60目筛得到萌发藜麦粉。

表1 萌发时间对藜麦芽长的影响

1.3.2 藜麦蛋白提取

采用碱溶酸沉法提取蛋白[19]。将萌发藜麦粉用石油醚进行脱脂,将脱脂粉按料液质量比1∶15添加蒸馏水,用1 mol/L NaOH溶液调节pH至9.0,3 800 r/min离心30 min收集上清液,重复提取2次;用1 mol/L盐酸调节pH至4.5,沉淀30 min,3 800 r/min离心30 min,收集沉淀。蛋白质沉淀加少量蒸馏水复溶,用1 mol/L NaOH调节pH至7.5,冷冻干燥,-20 ℃冷藏备用。

1.3.3 藜麦蛋白含量测定

参照GB/T 5009.5—2010凯氏定氮法进行测定。

1.3.4 结构特性测定

1.3.4.1 热学特性测定

称取2 mg藜麦蛋白,加入6 μL蒸馏水,密封压盖。于-20 ℃静置平衡过夜,用差示扫描量热仪扫描:氮气流速为50 mL/min,扫描温度30～150 ℃,升温速率为10 ℃/min,空白对照为空铝盒。

1.3.4.2 内源性荧光光谱测定

用0.01 mol/L、pH 7.0磷酸缓冲液配制0.2 mg/mL样品溶液。荧光分光光度计参数设置:激发波长λex=295 nm,扫描范围300～400 nm,狭缝5 nm。

1.3.4.3 表面疏水性测定

采用ANS荧光探针法[19]。用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制不同的质量浓度梯度(0.0625～1.0 mg/mL)的样品溶液。取各质量浓度样品溶液5 mL,加入25 μL 8 mmol/L的ANS溶液(磷酸缓冲液配制),振荡混匀,避光静置15 min。用荧光分光光度计测定荧光强度:激发波长λex=390 nm,发射波长λem=470 nm,狭缝5 nm,扫描速度1 000 nm/min。以荧光强度为纵坐标、蛋白质质量浓度为横坐标作图,通过线性回归分析计算初始段斜率,即为样品的表面疏水性指数。

1.3.4.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

取60 μL 1 mg/mL样品溶液,加入20 μL上样缓冲液,混匀,90 ℃金属浴加热10 min,冷却。上样量为30 μL,电压110 V,时间70 min。用考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液染色后,洗净背景,用凝胶成像系统拍摄电泳图谱。

1.3.5 功能特性测定

1.3.5.1 溶解度测定

参照张文刚等[20]的方法,并稍作修改。配制1 mg/mL样品溶液,测定蛋白质含量C0,涡旋1 min,3 800 r/min离心15 min,测定上清液蛋白质含量C。蛋白质含量用紫外吸收法测定[19],分别测定蛋白质溶液在280 nm和260 nm下的吸光值A280 nm和A260 nm,按公式计算:

C=1.45A280 nm-0.74A260 nm

式中:C为上清液蛋白质质量浓度/mg/mL;A280 nm为蛋白质溶液在280 nm下的吸光值;A260 nm为蛋白质溶液在260 nm下的吸光值;C0为样品溶液蛋白质质量浓度/mg/mL。

1.3.5.2 乳化性及乳化稳定性测定

参考付嘉阳等[21]的方法。用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸缓冲液配制1 g/mL样品溶液。取6 mL样品溶液,加入2 mL大豆油,混合,在室温下用高速分散机10 000 r/min高速剪切1 min,静置,分别在0、10 min时迅速从容器底部取出50 μL样品溶液,加入5 mL 0.1 g/mL SDS,混匀后于500 nm测吸光度A0、A10。空白对照为0.1 g/mL质量浓度SDS。乳化性(EAI)和乳化稳定性(ESI)按公式计算:

式中:EAI为乳化性/m2/g;ESI为乳化稳定性/min;T为换算常数2.302;N为稀释倍数;C为蛋白质的质量分数/g/mL;ψ为大豆油的体积分数,0.25;Δt为静置时间差,10 min。

1.3.5.3 起泡性和泡沫稳定性测定

参考付嘉阳等[21]的方法,并稍作修改。称取0.15 g样品于离心管中,加入15 mL蒸馏水,于10 000 r/min高速搅打2 min,采用刻度尺记录搅打前、后分散液体积,静置30 min再次记录体积。起泡性(FC)及泡沫稳定性(FS)按照公式计算:

式中:FC为起泡性/%;FS为泡沫稳定性/%;V1、V2、V3分别为搅打前、后及静置30min后的分散液体积/mm。

2 结果与分析

2.1 萌发时间对藜麦粉蛋白质含量的影响

萌发时间对藜麦粉蛋白质含量的影响见图1。随着萌发时间的延长,藜麦粉的蛋白质含量呈现增大趋势,萌发处理后的藜麦粉的蛋白质含量显著提高(P<0.05),这与韩雅盟等[22]研究结果一致。分析原因,在萌发过程中,藜麦种子生长发育需要消耗供能物质淀粉,新陈代谢提高,导致其总干基质量降低,从而使得蛋白质含量相对增加[22];新生长的芽中也会合成新的蛋白质[23],同时蛋白质作为储能物质也会被消耗,随着萌发时间的延长,藜麦蛋白质含量在生成和分解的过程中不断变化,且总体呈上升趋势。所以,萌发处理可以提高藜麦的蛋白含量,并且在72 h内,萌发时间越长,蛋白质含量越高。

注:图中字母表示显著性水平(P<0.05)。下同。

2.2 萌发时间对藜麦蛋白结构特性的影响

2.2.1 热学特性

表2为萌发藜麦蛋白质的热变性起始温度T0、峰值温度Tp、终止温度Te和焓值ΔH。萌发后藜麦蛋白存在2个热变性区间,峰值温度分别为99～108、119～138 ℃,温度范围跨度较大,可能是由藜麦球蛋白和清蛋白的复杂组成引起的[24]。与未经萌发处理(萌发0 h)的藜麦蛋白相比,萌发藜麦蛋白热变性峰值温度Tp显著增大(P<0.05)。经萌发处理后藜麦蛋白质的热稳定性显著提高。较高的热稳定性有益于藜麦在需高温加热食品中的应用。随着萌发时间的延长,藜麦蛋白的热变性焓值ΔH快速下降,在萌发72 h时几乎为0。说明在萌发过程中藜麦蛋白三级结构遭到破坏,蛋白质发生变性,且萌发时间越长,变性蛋白质占比越高。

表2 萌发时间对藜麦蛋白热特性参数的影响

2.2.2 内源性光谱

内源性荧光光谱中的最大吸收波长(λmax)与蛋白中芳香族氨基酸残基所处的微环境有关,本研究扫描范围为300～400 nm,主要以色氨酸(Trp)作为内源探针观测蛋白质结构的变化情况[25]。图2为萌发藜麦蛋白的内源性荧光光谱图。可以看出,萌发0 h时,藜麦蛋白的λmax为343 nm,此时Trp多分布在蛋白质分子表面,其分子间的作用力限制了Trp与水分子的接触[26];随着萌发时间的延长,最大吸收波长发生红移,λmax增大,这表明萌发处理后Trp逐渐暴露在极性环境中,蛋白质空间结构发生改变,疏水性降低[25];随着萌发的继续进行,萌发藜麦蛋白质的最大荧光强度逐渐降低,这可能与位于蛋白质表面的Trp逐渐被氧化、数量减少有关[26]。

图2 萌发藜麦蛋白的内源性荧光光谱

2.2.3 表面疏水性

表面疏水性体现了蛋白质表面氨基酸的疏水作用,对蛋白质的功能特性有重要影响。萌发藜麦蛋白的表面疏水性指数变化如图3所示,随着萌发的进行,藜麦蛋白的表面疏水性指数显著降低(P<0.05)。在萌发过程中,为满足植株生长发育的需求,部分藜麦蛋白质将被酶水解,蛋白质结构发生改变,包埋在分子内部的氨基酸残基被暴露出来并发生氧化,导致蛋白质表面的疏水性氨基酸残基数量减少,使得ANS与蛋白质结合的数量降低,最终表现为表面疏水性的降低[5]。许英一等[27]研究发现热处理改性燕麦蛋白的表面疏水性和内源性荧光强度呈极显著的线性正相关,许晶等[27]研究发现大豆分离蛋白的溶解性与表面疏水性呈显著负相关。随着萌发时间的增加,藜麦蛋白的表面疏水性与内源性荧光强度均呈下降趋势,溶解度呈上升趋势,这与许英一等[27]、许晶等[28]的研究结果一致。

图3 萌发时间对藜麦蛋白表面疏水性指数的影响

2.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

藜麦中储存蛋白主要由2S清蛋白(35%)和11S球蛋白(37%)组成,均通过二硫键维持蛋白质分子的稳定性[29]。SDS-PAGE结果表明,在萌发48 h前,亚基条带数目不变,但部分亚基条带的强度(相对含量)却有显著的改变(图4)。在未萌发的藜麦蛋白质中,发现条带中显示出了A亚基(酸性亚基,32～39 ku)、B亚基(碱性亚基,22～23 ku)、清蛋白(108～9 ku)。其中,20～23 ku和32～39 ku的条带最为显著,即这2个亚基的相对含量最高,与张文刚等[20]报道分析结果一致。分子质量为100、57、32～39 ku的亚基相对含量均呈下降趋势,在萌发72 h时几乎消失,而分子质量为20～23、10～12 ku 的亚基相对含量较高。这可能是因为蛋白质参与了藜麦的萌发过程,高分子质量的蛋白质被蛋白质分解酶分解为较低分子质量的蛋白质[5, 7]。也有可能是由于蛋白质被分解成足够小的碎片,逃逸出凝胶,考马斯蓝染色无法检测到[30]。

图4 萌发藜麦蛋白的SDS-PAGE分析图谱

2.3 萌发时间对藜麦蛋白功能特性的影响

2.3.1 溶解度

由表3可知,藜麦蛋白质的溶解度随萌发时间的延长呈升高趋势(P<0.05),在萌发72 h时,藜麦蛋白的溶解度达到最高(95.9%)。这是由于萌发处理后藜麦蛋白质的结构发生改变,其表面的疏水性氨基酸残基数量减少、表面疏水性降低,故蛋白质的溶解度升高。同时,在藜麦萌发过程中,由于种子呼吸代谢,在内源酶作用下存在蛋白质的分解和新蛋白的合成,而组成和结构的改变可能使得蛋白质具有更好的亲水性,溶解度升高[19]。蛋白质的溶解度是其发挥营养价值和功能特性的基础,萌发处理可改善藜麦蛋白的溶解度,有利于藜麦蛋白制品的开发。

表3 萌发时间对藜麦蛋白功能特性的影响

2.3.2 乳化性及乳化稳定性

乳化性是指将油相和水相混合形成乳化液的能力。利用蛋白的乳化性,可以将其用于生产冰淇淋类食物以及化妆品、包装材料等某些化工产品[8]。从表3可以看出,萌发显著提高了藜麦蛋白的乳化能力(P<0.05)。随着萌发时间的延长,藜麦蛋白的乳化性迅速增大,在萌发72 h时,达到最高(27.83 m2/g),比未萌发的藜麦蛋白提高了1.4倍。这是由于萌发过程中藜麦蛋白质溶解度增加,能到达油-水界面的蛋白质颗粒增多,乳化性提升[7];并且在萌发过程中蛋白质组成和结构发生变化,当暴露高数量的疏水基团时,乳液中乳化剂和油滴之间的结合能力变强,疏水基团的增加改善了油-水界面的分子排列,从而提高了加工过程中的乳化性[21]。

乳化稳定性是表征乳浊液保持乳浊状态的能力。由表3得知,随着萌发时间的延长,藜麦蛋白的乳化稳定性迅速升高(P<0.05),萌发72 h时藜麦蛋白乳化稳定性达到最高值68.59 min,比未萌发的藜麦蛋白提高了4.2倍。这可能是萌发过程中蛋白质结构伸展,暴露更多疏水氨基酸,蛋白质表面活性及柔性增强,改善了乳化稳定性[19]。同时,萌发藜麦蛋白在蛋白酶的作用下界面特性部分发生改变,并且伴随着新蛋白的生成,一些新蛋白或蛋白亚基在油-水界面上相互作用更紧密,界面强度提高,使乳化稳定性得以改善[7]。此外,酶解、去皂化以及其他成分(如糖蛋白)会影响蛋白质乳化性质的表现[31]。

2.3.3 起泡性和泡沫稳定性

蛋白质的起泡性与其组成结构、蛋白浓度、蛋白质膜的流变性等有关,可以赋予食品蓬松柔软的质感和良好的口感[19]。由表3可知,萌发处理对藜麦蛋白的起泡性及泡沫稳定性有显著影响(P<0.05)。随着萌发时间的延长,藜麦蛋白的起泡性呈下降趋势,泡沫稳定性则先上升后下降,在萌发24 h时达到最大值(95.39%)。分析原因,随着萌发的进行,部分藜麦蛋白质水解形成分子质量较小的亚基结构,藜麦蛋白可溶性提高,使其在空气-水界面具有更好的吸附能力,改善了藜麦蛋白的泡沫特性[19]。而藜麦蛋白起泡性呈逐渐下降的趋势,可能是由于蛋白质的起泡性与蛋白质浓度有关。有研究表明,随着蛋白质浓度的增大,样品溶液的黏度也增大,有利于泡沫的形成;但当蛋白质浓度过大时,溶液黏度也过大,则不利于泡沫的形成,起泡性逐渐降低[32]。

3 结论

经过萌发处理,藜麦粉的蛋白质含量显著提高,萌发藜麦蛋白的热稳定性提高,起泡性降低,可用于蛋糕、面包等食品加工,增加营养、丰富口感;溶解度、乳化性和乳化稳定性增大,表面疏水性减弱,可更好地应用于冰淇淋、乳制品等加工;萌发藜麦蛋白的空间结构发生明显变化,萌发藜麦蛋白的大分子亚基数量减少而小分子亚基数量增加。萌发使得藜麦蛋白具有更好的加工性能,是一种值得推广的加工方法。