黑苦荞多酚提取及其对油脂的抗氧化研究

曹叶霞, 李慧卿, 陈雪涛, 魏婷婷

(忻州师范学院化学系,忻州 034000)

黑苦荞是荞麦的一种,多生长在高寒地区,有极高的营养价值[1],不仅富含芦丁和硒元素,同时还含有18种氨基酸、9种脂肪酸、叶绿素、粗蛋白、碳水化合物、维生素、矿物质及微量元素,还有丰富的膳食纤维[2]。长期食用黑苦荞有助于预防高血压等多种疾病[3]。

曾俊等[4]研究了黑苦荞黄酮类化合物的提纯及抑菌活性,结果证明其对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌活性。王菲等[5]研究了黑苦荞麦黄酮的提取及体外抗氧化活性,表明其具有较好的体外抗氧化能力。鲍涛等[6]研究黑苦荞米黄酮提取工艺优化及其降血糖活性,实验结果表明,黑苦荞米黄酮具有较好的辅助降血糖功效。Bao T等[7]研究黑苦荞米黄酮模拟消化前后活性成分含量变化,以及模拟消化对其抗氧化及降血糖活性的影响。黑苦荞米黄酮模拟消化前后对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制能力,同时可以促进细胞对葡萄糖的消耗以及细胞糖原的生成,具有较好的降血糖活性。对于黑苦荞中多酚的研究很少[8],因此用响应面方法探究了超声波辅助提取黑苦荞多酚,同时研究了对油脂的抗氧化性,以期扩大黑苦荞的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

黑苦荞:产于山西雁门关。用蒸馏水将黑苦荞洗净,在60 ℃烘箱中恒温干燥,然后将其粉碎,并过50目筛,装于棕色瓶中置阴凉处备用。

鲜榨葵花籽油、花生油、花生油和大豆油;没食子酸(99%);2,6-二叔丁基对甲酚和没食子酸丙酯都为食品级;福林酚、碘化钾、硫代硫酸钠、可溶性淀粉、乙醚、异丙醇、三氯甲烷、冰乙酸和三氯甲烷等其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-400KED型高功率数控超声波清洗器,EVOLUTION220紫外分光光度计,V-5100 SPECTROPHOTOMETER紫外可见分光光度计,DHG-9050A电热恒温鼓风干燥箱,SL-500型高速多功能粉碎机。

1.3 实验方法

1.3.1 最佳吸收波长的确定

取0.050 0 g没食子酸溶解于蒸馏水中,然后定容于100.00 mL容量瓶得到质量浓度为0.50 mg/mL的标准溶液。取经稀释了一定浓度的没食子酸标准溶液1.00 mL于10 mL比色管中,依次加入0.50 mL福林酚试剂,再加入3.80 mL质量分数为8%碳酸钠溶液,充分混匀,暗处静置2 h,取出后进行紫外全波段测定,同法做黑苦荞多酚提取液紫外可见全波段扫描,选出最大吸收波长。

1.3.2 没食子酸标准曲线的制备

取0.50 mg/mL的标准溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于10 mL比色管中,按照1.3.1的方法于最大吸收波长下测定吸光度,由此制得标准曲线。

1.3.3 黑苦荞多酚的提取及测定

取1.000 0 g的黑苦荞粉,按照实验设定方案进行提取,然后进行离心分离10 min,取上清液进行多酚含量的测定。然后根据标准曲线和式(1)计算黑苦荞多酚的提取量。

(1)

式中:C为多酚质量浓度/mg·mL-1;V为提取液的体积/mL;m为样品的质量/g。

1.3.4 黑苦荞多酚提取的单因素实验

料液比选取1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL;超声提取温度25、35、45、55、65、75 ℃;超声提取时间20、30、40、50、60 min;乙醇体积分数20%、30%、40%、50%、60%;超声功率200、240、280、320、360 W,除每个单因素变化外,其他的固定条件是:乙醇体积分数60%、料液比1∶30 g/mL、35 ℃、400 W、30 min,进行3次平行单因素实验,从而选出对黑苦荞多酚提取量的影响显著的因素。

1.3.5 响应面实验设计

在单因素实验的基础上,根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理,选取料液比、乙醇体积分数 超声时间和超声波功率4个因素为自变量,以黑苦荞多酚提取量为响应值,采用四因素三水平的响应面分析方法, 响应面实验设计见表1。

表1 响应面实验设计表

1.3.6 黑苦荞多酚对油脂的抗氧化作用

在最佳工艺条件下提取1 000 g黑苦荞,得到黑苦荞多酚粗提液,用体积分数60%的乙醇经XDA-6型大孔树脂柱洗脱粗提液,合并流出液先旋蒸浓缩,再进行真空冷冻干燥,最终得到目标纯化物黑苦荞多酚。

纯化后的黑苦荞多酚按照油质量比为0.02%、0.04%、0.06%、0.10%分组,先用少量无水乙醇溶解,然后分别加入到30 g大豆油、玉米油、葵花籽油、花生油中,再加入适量单硬脂酸甘油酯使其在油相中混合均匀,并以空白油样作对照,避光处理后,在(60±1)℃的恒温烘箱中强制氧化、每隔12 h振摇1次同时交换位置,每48 h按GB 5009.227—2016的方法,称取2.000 0 g～3.000 0 g的油样测定各油样的过氧化值(POV)。同时,按此方法测定二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)的过氧化值并与黑苦荞多酚进行比较。

2 结果与分析

2.1 最佳吸收波长的确定

标准液和样品提取液的紫外可见全波长扫描如图1所示,标准液和样品提取液在753 nm处出现最大吸收峰,故选择753 nm为样品测定的最佳波长。

图1 标准液和样品提取液的紫外可见全波长扫描

2.2 没食子酸标准曲线

以没食子酸标准品质量浓度c为横坐标,吸光度A为纵坐标绘制标准曲线,得到线性方程为y=0.107 8x+0.008 5,相关系数为R=0.999 7。线性范围为0.0～0.5 mg/mL。

2.3 单因素实验结果

各因素对黑苦荞提取量的影响如图2所示,黑苦荞籽粒多酚的提取量随超声时间的增加而迅速升高,当超声时间增加到50 min时,提取量最高,而后很快下降,这可能是因为随着超声作用时间的延长由于超声波所具有的非常强烈的机械粉碎小分子作用和空化作用,极大地增大了物质分子的运动速率和频率,从而提高了多酚的溶出率,但超过50 min,溶质多酚可能被氧化,导致多酚含量下降。因此,选择超声时间50 min为最佳时间。

图2 各因素对黑苦荞提取量的影响

随着超声功率的增加,多酚提取量逐渐增加,当增加到280 W时,多酚提取量最大,而后随着超声功率的增大多酚提取量下降,这可能是因为随着超声波功率的增加空化作用增强,使黑苦荞粉的活性多酚成分迅速溶出,当超过280 W时,有部分提取出来的多酚被氧化,导致含量下降。因此,选择超声功率为280 W为最佳功率。

随着乙醇体积分数逐渐增大,黑苦荞总酚提取量急剧增大,当增大到乙醇体积分数为40%时,多酚提取量最大,而后随乙醇体积分数增大,多酚提取量呈下降且平稳趋势,这可能是因为溶质和溶剂之间的极性关系,当乙醇体积分数在20%～40%时,多酚的极性与乙醇体积分数的极性相似,根据相似相溶原理,极性越相近溶解度越大,所以溶质溶出较多,多酚提取量增加,而随乙醇体积分数越来越大,多酚的极性和乙醇体积分数极性有较大差异,溶质便不会溶出,故提取量减少。因此,选择乙醇体积分数40%为最佳溶剂浓度。

随料液比增大总酚提取量增大,当溶剂增大到30 mL时,提取量最大,而后随溶剂体积增大稍有下降趋势且逐渐趋于平稳,这可能是因为随着溶剂体积的增大溶质细胞内外的渗透压的变化,导致细胞内外多酚浓度产生了梯度,使多酚的溶出增多,即增大了其提取量。当溶剂体积继续增大时,虽然由于细胞膜两边浓度大小不一样,会有渗透压作用存在,但是溶剂分子也会分散超声波对多酚的作用,由于后者的作用强于前者,故溶剂体积增大反而多酚提取量会下降。因此,选择1∶30为最佳料液比。

超声温度对黑苦荞多酚的提取量影响不大,考虑到成本,选择在室温下进行提取。

2.4 响应面实验设计及结果

利用Design-Expert.V8.0.6软件设计实验,根据Design-Expert.V8.0.6设计四因素三水平响应面实验分析,响应面实验设计与结果见表2。

表2 响应面实验设计与结果

2.4.1 响应面法提取工艺优化以及方差分析

经过多元回归拟合,得到Y(提取量)与A、B、C、D之间的关系式如下:

Y=27.902+0.26A-0.012 5B+1.395 83C+1.448 33D-1.707 5AB-0.53AC+0.092 5AD+2.677 5BC+2.522 5BD+2.755CD-1.855 17A2-5.693 92B2-3.973 92C2-3.742 67D2。模型确定系数R2=0.975 8,模型调整确定系数R2=0.951 5,说明该有95.15%的实验数据可以解释,有较好的可靠性。回归模型方差分析结果见表3。整体模型P<0.000 1,失拟项P=0.104 2>0.05不显著,说明模型与数据的拟合度较高,适合分析此实验结果,其中C、D、AB、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2差异性高度显著。

表3 回归模型方差分析结果

2.4.2 相互交互作用影响

由表3可知,超声时间和乙醇体积分数、乙醇体积分数和料液比、乙醇体积分数和超声功率、料液比和超声功率的交互作用对黑苦荞多酚的提取极显著。

2.4.3 验证实验

通过响应面实验分析法得最佳工艺条件为:超声功率为295.78 W、超声时间为49.41 min、料液比为1∶33.78、乙醇体积分数为41.85%,提取量的理论值为28.44 mg/g。分析结果选取符合实际且提取效率最高的条件:超声功率为280 W、超声时间为49 min、料液比为1∶33、乙醇体积分数为42%,在此条件下进行3次平行实验,测得黑苦荞中多酚提取量分别为28.38、28.43、28.41 mg/g,相对标准偏差为0.40%,与理论预测值相差0.11%,说明黑苦荞中多酚的超声波辅助提取工艺可以通过响应面优化分析法来进行回归分析。

2.5 黑苦荞多酚对油脂的抗氧化效果

2.5.1 不同浓度黑苦荞多酚对大豆油、葵花籽油、花生油、玉米油的抗氧化作用

经纯化得到黑苦荞多酚22.32 g,其中多酚质量分数为81.23%。从图3～图6可以看出,只有黑苦荞多酚对大豆油的抗氧化作用随着浓度的增大而增强,质量分数0.06%的黑苦荞多酚对葵花籽油的抗氧化作用最强,对花生油和玉米油的抗氧化作用在强制氧化后期质量分数为0.06%的黑苦荞多酚表现较强。可能由于不同食用油含有的脂肪酸种类和数量、微量活性成分的种类和数量以及加工工艺引起微量活性成分数量的变化有关,因此对大豆油的抗氧化作用可以选用0.10%的黑苦荞多酚,而其余3种油脂选用质量分数为0.06%的黑苦荞多酚。

图3 黑苦荞多酚对大豆油的抗氧化作用

图4 黑苦荞多酚对葵花籽油的抗氧化作用

图5 黑苦荞多酚对花生油的抗氧化作用

图6 黑苦荞多酚对玉米油的抗氧化作用

2.5.2 黑苦荞多酚、BHT和PG分别对大豆油、葵花籽油、花生油、玉米油的抗氧化作用

从图7～图10中可以看出质量分数为0.06%的黑苦荞多酚对花生油的抗氧化作用不及BHT和PG;

图7 不同抗氧化剂对大豆油的抗氧化作用

图8 不同抗氧化剂对葵花籽油的抗氧化作用

图9 不同抗氧化剂对花生油的抗氧化作用

图10 不同抗氧化剂对玉米油的抗氧化作用

对葵花籽油和玉米油的抗氧化作用强于BHT但不如PG;对大豆油的抗氧化作用稍强于BHT,同PG相当。可能由于黑苦荞多酚、BHT和PG与不同食用油油脂膜双层的亲和力差异有关。

黑苦荞富含多酚类化合物和较强的抗氧化活性[9],这与本研究结果一致。多酚可以与活性氧和活性氮结合,清除体内过量的自由基,从而具有较强的抗油脂氧化能力[10]。其可能的作用机理为多酚分子中的酚羟基提供活泼的氢质子,能有效清除氧自由基,从而预防脂质过氧化; 其次,酚羟基和过氧化自由基结合生成稳定的化合物,进一步阻止了氧化过程。可能由于不同种类的食用油脂肪酸含量及油脂种类[11],也可能与油脂体膜的亲和力不同[12],导致黑苦荞多酚对大豆油的抗氧化作用最强,其次是葵花籽油和玉米油,对花生油最差不如合成抗氧化剂,具体原因还有待进一步研究。

3 结论

黑苦荞多酚的超声提取最优条件:超声功率为280 W、超声时间为49 min、料液比为1∶33、乙醇体积分数为42%,在此工艺提取条件下其多酚提取量可达28.43 mg/g,与理论预测值相差0.11%,说明超声波辅助提取黑苦荞中多酚可以通过响应面优化法来进行回归分析。其中超声功率影响最大,料液比次之,超声时间较小,乙醇体积分数最小。黑苦荞多酚对油脂的抗氧化结果表明黑苦荞多酚对大豆油的抗氧化作用同浓度呈正的量效关系,而且同常用抗氧化剂比较对大豆油的抗氧化作用稍强于BHT,同PG相当;但是对葵花籽油和玉米油的抗氧化作用强于BHT但不如PG。