冷冻球磨制备糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的理化、流变学特性及体外消化率的研究

郝宗围, 余振宇, 王 宇, 李 超, 谷宗艳, 张 强, 胡 尧, 韩嵊峻,肖亚庆, 刘英男, 刘 抗, 郑明明, 周裔彬

(安徽农业大学食品加工研究院;安徽省农产品加工工程实验室;农业农村部江淮农产品精深加工与资源利用重点实验室;安徽农业大学茶与食品科技学院,合肥 230036)

糯米是我国许多食品的重要原料,具有较高的淀粉含量。然而,糯米淀粉制品中因支链淀粉含量较高,易于消化吸收,且蒸煮后容易成团,易使人胃部不适[1]。此外,糯米淀粉的快速消化淀粉(RDS)含量较高,食用后血糖反应水平较高,从而导致血糖水平不稳定,并增加罹患Ⅱ型糖尿病和心血管疾病的风险[2]。另一方面,抗性淀粉(RS)已被证明具有大量的生理功能[3]。因此,提高糯米淀粉的抗性特性,抑制对其餐后血糖反应,对于满足消费者膳食需求具有重要意义。

添加一些非淀粉多糖( NSP )可能会改变米类制品的酶促消化行为,这种变化的潜在机制可能因其结构而异,其主要原因是在淀粉颗粒表面形成对抗淀粉酶的“屏障”以减少淀粉消化[4]。NSP还可以直接抑制非竞争性物质中的α-淀粉酶,抑制淀粉消化,从而抑制餐后血糖升高[5]。Kong等[6]研究表明,虫草多糖可降低小麦淀粉浸出直链淀粉的含量,降低小麦淀粉糊的黏度和糊化度。此外,虫草多糖与小麦淀粉浸出的直链淀粉形成氢键,包围在淀粉颗粒表面,从而抑制淀粉膨胀和糊化,虫草多糖还可以降低小麦淀粉中RDS的含量,提高SDS和RS的含量。β-葡聚糖是由D-葡萄糖单体通过β-糖苷键连接而成的大分子多糖,广泛存在于植物和微生物中[7],在健康食品和药品中发挥着重要作用,具有免疫调节、抗肿瘤活性、降低血清胆固醇以及预防肥胖等生理功能[8]。β-葡聚糖作为一种可溶性膳食纤维,会影响淀粉的消化率,这可能有助于降低食物中的血糖指数 (GI)[9]。因此,这可能为开发缓慢消化、血糖反应水平较低的食物提供一个新的选择。

通过物理、化学、生物等多种方法延缓淀粉的消化,生产低GI功能性食品,已受到越来越多研究者关注。球磨处理是一种较常见的物理改性方法,主要利用碰撞、冲击、剪切或其他机械作用来改变淀粉颗粒的结构和特性,满足生产特定产品的需要[10]。冷冻球磨是用液氮来降低球磨过程中产生的热量,减少研磨过程因热量的变化造成对处理物的影响,淀粉与非淀粉多糖共研磨是一种更安全、更方便、更高效的天然淀粉改性方法。因此,利用冷冻球磨处理对糯米淀粉与β-葡聚糖共研磨制备其复合物, 探究不同β-葡聚糖添加量复合物理化、流变学特性及体外消化率的影响,为开发缓慢消化、血糖反应水平较低的糯米制品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

圆糯米(市售),燕麦-β-葡聚糖(市售),α-葡萄糖苷酶(300 U/mL),α-淀粉酶(100 U/mg),所有化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

冷冻行星液氮球磨机,Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱,RVA-TecMaster型快速黏度分析仪,DHR-1 流变仪,VICTOR Nivo 酶标仪,Mastersizer2000型激光粒度仪,DSC 8000差示扫描量热仪,S-4800冷场发射扫描电子显微镜。

1.3 方法

1.3.1 糯米淀粉的制备

糯米置于去离子水浸泡过夜,将浸泡糯米打浆,用纱布过滤,滤掉较大糯米颗粒。配置0.2%NaOH溶液,调节糯米粉乳液pH在10左右,混合、搅拌,浸泡3～5 h,收集下层沉淀,反复水洗,每次倒掉上清液,直至调pH为7左右,于5 000 r/min高速离心机中离心20 min,刮去表层黄色物质,取离心白色沉淀物,置于托盘,在45 ℃烘箱干燥过夜,取出粉碎过100目筛,得到糯米淀粉(糯米淀粉主要化学组成含量:水质量分数为10.80%,蛋白质、脂肪、灰分、淀粉的质量分数分别为0.25%、0.08%、0.17%、88.70%)。

1.3.2 冷冻球磨处理制备糯米淀粉-β-葡聚糖复合物

将球磨机设定转速为500 r/min,并每隔10 min交替旋转方向,期间保持液氮开启状态,在球磨过程中温度稳定保持在-18～-10 ℃范围内,50 g糯米淀粉装入球磨罐中,分别加入质量分数5%、10%、15%、20%β-葡聚糖(以淀粉干基计,下同),处理时间为60 min,并分别标记为WRS-5%β-glucan、WRS-10%β-glucan、WRS-15%β-glucan、WRS-20%β-glucan,获得不同添加比的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物(简称“复合物”),以球磨处理60 min的糯米淀粉(WRS-60)作为对照组。

1.3.3 糯米淀粉-β-葡聚糖复合物粒径分布测定

用激光粒度仪测定粒径并分析,分别称取0.1 g不同添加量的样品,加入适量蒸馏水,振荡,使其分散均匀。选择颗粒折射率为1.52,通过仪器测量得到D0.1、D0.5、D(4,3)、D(3,2)、D0.9/μm。

1.3.4 糯米淀粉-β-葡聚糖复合溶解度和膨胀度的测定

将0.2 g样品分散在10 mL蒸馏水中,质量记为m1。分别在55、75、95 ℃,水浴锅中充分搅拌20 min,4 000 r/min离心10 min,将上清液置于105 ℃烘箱,烘干直至恒重,得到水溶性样品的质量m2,下层沉淀为膨胀部分,质量记为m3。测得不同温度时的溶解度和膨胀度,按照公式计算。

1.3.5 糯米淀粉-β-葡聚糖复合物微观结构观察

取适量样品均匀分散在双面胶,然后粘附于载物架上,喷金30 s,置于扫描电镜下观察复合物的表观形貌,加速电压为3 kV,选择3 500倍放大观察并拍片。

1.3.6 糯米淀粉-β-葡聚糖复合物XRD测定

按照Ahmad等[11]的方法,并作适当修改,测定复合物的晶型和相对结晶度。衍射条件:铜靶电压30 kV,扫描速率5(°)/min,衍射角2θ在5°～35°范围的数据,得到XRD图谱。

1.3.7 糯米淀粉-β-葡聚糖复合物FTIR光谱测定

根据Chi等[12]的方法,并作适当的修改。准确称取样品1 mg,将样品与溴化钾混合均匀并压片。以空气为参比背景,光谱扫描范围为4 000～400 cm-1,分辨率为2 cm-1,扫描64 次。

1.3.8 糯米淀粉-β-葡聚糖复合物糊化特性测定

称取样品1.5 g置于RVA专用铝桶中,加入23.5 mL蒸馏水,用旋转浆充分分散,测定程序:起始温度50 ℃,保持温度2 min,6 ℃/min升温到95 ℃,保持温度5 min,6 ℃/min降温至50 ℃,保持温度2 min;起初旋转浆以960 r/min搅拌10 s,其后保持转速160 r/min。

1.3.9 流变学测定

1.3.9.1 静态剪切流变特性

将RVA的样品立即冷却至室温。根据黎欢等[14]的方法稍作修改,流变仪配有直径40 mm的平行板,间隙值选择为1 000 μm。温度为25 ℃,剪切速率在0.1～100 l/s范围内进行稳态剪切流变实验,采集和记录由计算机自动完成。数据采用幂律模型进行拟合。

τ=Kγn

式中:τ为剪切应力;K和n分别为稠度和流动特性的指标;γ为剪切速率。

1.3.9.2 动态黏弹性的测定

将RVA制备的复合物立即冷却至室温。选择夹具为40 mm不锈钢平板,频率范围为0.1～10 Hz,应变为1%,温度为25 ℃,以获得复合物的动态模量。

1.3.10 糯米淀粉-β-葡聚糖复合物体外消化实验

1.3.10.1 DNS标准曲线绘制

按照郝赫男[15]的方法,并作适当修改。DNS法测定葡萄糖标准曲线:准备6支试管,将1.0 g/L葡萄糖标准溶液以0.2 mL为梯度0.0～1.0 mL加入试管中,加蒸馏水至1 mL,在每个试管加入2 mL的DNS试剂,煮沸5 min,用冰水迅速冷却,用蒸馏水补齐至15 mL,摇匀。用酶标仪在540 nm处测量吸光度,以葡萄糖浓度(x)为横坐标、吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程y=0.714 7x+0.040 9,R2=0.999 3。

1.3.10.2 糯米淀粉-β-葡聚糖复合物功能性淀粉测定

RDS被定义为在20 min内消化的淀粉部分;SDS被定义为在20～120 min内消化的淀粉部分; RS被定义为在120 min内没有消化的淀粉部分。根据Englyst等[16]测定淀粉体外消化的方法,并进行一些修改如下。称量200 mg样品于离心管,加入5～6粒玻璃珠和15 mL pH 5.2醋酸钠缓冲液,95 ℃水浴10 min。加入5 mL混合酶溶液[α-淀粉酶(100 U/mg)和葡萄糖苷酶(300 U/mL)]。酶解20和120 min分别取出0.5 mL酶解液,并加入4.5 mL无水乙醇灭酶活,然后以4 000 r/min离心10 min。通过DNS法测定上清液葡萄糖含量。RDS、SDS和RS的含量按公式计算:

RDS= [(G20-G0)×0.9]/TS×100%

SDS= [(G120-G20)×0.9]/TS×100%

RS=(1-RDS-SDS)×100%

式中:G0为未水解时的葡萄糖量;G20为水解20 min内释放的葡萄糖量;G120为水解120 min内释放的葡萄糖量;TS为总淀粉干基的质量/mg。

1.3.10.3 淀粉的水解曲线

分别在水解时间为20、60、120、180 min时取样,取样时间点的葡萄糖含量(Gt)可以由葡萄糖标准曲线计算得出,并根据公式计算水解率。

1.3.10.4 水解指数HI和血糖指数pGI的计算

参照前人研究模拟人体肠道消化[17,18],淀粉水解曲线遵循一级反应方程为:

C=C∞(1-e-kt)

式中:C为时间t的样品水解率;C∞为平衡时样品水解率;k为消化动力学常数。

淀粉样品的水解指数(HI)为各样品的水解曲线下面积(AUC)与空白对照水解曲线下面积比值的百分数:

pGI=39.71+0.549HI

1.4 数据处理与分析

所有指标均做3次以上独立重复实验。数据结果用平均值±标准差表示,采用Statistix 8软件对数据进行方差分析以比较数据间的显著性差异,P<0.05表示差异显著。利用Origin 2021软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同添加量糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的粒径分布分析

由表1可知,对照组糯米淀粉的中位粒径为10.64 μm。其中,D(4, 3) 、D(3, 2)显著高于5%质量分数的糯米淀粉复合物。这主要是因为冷冻球磨的机械活化作用增强,使得淀粉颗粒比表面积不断增加,产生更多的表面自由能,表面活性也所提高,导致粒径增大现象[10]。随着β-葡聚糖添加量的增加,复合物颗粒粒径增加,粒径分布出现右移趋势。当β-葡聚糖的质量分数为20%时,复合物的D0.1、D0.5、D0.9分别增加到5.13、12.32、46.32 μm。这可能是因为冷冻球磨过程中,β-葡聚糖与糯米淀粉分子通过氢键相互作用,紧紧吸附在淀粉颗粒周围[19],导致粒径分布出现增加趋势。

表1 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的粒径参数

2.2 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的溶解度、膨胀度分析

图1显示了从55～95 ℃,对照组糯米淀粉和糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的膨胀度和溶解度。结果表明,随着温度的升高,其膨胀度和溶解度显著增加。这可能是由于复合物在水溶液中加热,氢键发生断裂,晶体结构被破坏,水分子通过氢键与直链和支链淀粉的羟基相连,导致颗粒膨胀和溶解度增加[20]。进一步分析可知,在不同温度(55、75、95 ℃)下,淀粉复合物的溶解度和膨胀度随着葡聚糖添加量的增加而下降。这主要是因为水溶性的β-葡聚糖分散溶解,增大了液相体系的黏度,也与淀粉颗粒竞争争夺自由水,导致淀粉颗粒的膨胀和其中淀粉分子的溶出受到了抑制,这与焦昆鹏等[21]研究结果相一致。

图1 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的膨胀度、溶解度

2.3 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的微观结构分析

如图2所示,经冷冻球磨处理,糯米淀粉颗粒呈不规则形状,表面粗糙,有孔隙。这与前人研究结果一致[1]。当β-葡聚糖质量分数在10%范围内,β-葡聚糖紧紧依附在淀粉颗粒周围,形成紧凑的结构。这可以抑制淀粉酶扩散到颗粒内部[2]。随着β-葡聚糖添加量的增加,复合物表面较粗糙,出现聚集、结块的现象。这可能是由于球磨过程中施加的机械力使淀粉分子间氢键断裂,淀粉颗粒螺旋结晶排列被破坏,导致淀粉分子双螺旋中的更多羟基暴露,有利于葡聚糖的渗透及其相互作用。因此,β-葡聚糖和淀粉相互紧紧依附,出现团聚、结块的现象,这与粒径增加的结果一致。

图2 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的扫描电镜图

2.4 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物XRD分析

由图3可知,经过冷冻球磨处理的对照组糯米淀粉均在衍射角2θ为15.5°、17.0°、18.0°和 23.5°处出现4个较强的衍射峰,其结构属于典型的A型淀粉[22],β-葡聚糖则呈无序的晶体结构。随着β-葡聚糖的加入,衍射峰出现在相似位置,但峰的强度有较大变化。由表2可知,当β-葡聚糖的添加量为20%时,淀粉的结晶度从18.75%下降至0.83%。这可能是由于球磨后糯米淀粉与β-葡聚糖相互作用,

图3 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的XRD衍射图谱

表2 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的XRD、R1 047/1 022、R1 022/995、FWHM以及静态流变拟合参数

在葡聚糖存在时,球磨会导致淀粉颗粒晶体区域的破坏,使得淀粉从结晶结构转变为无定形状态,导致复合物的相对结晶度降低[23]。此外,由于球磨的机械力作用,导致淀粉链中羟基的暴露增加[1],β-葡聚糖因其丰富的羟基可能通过氢键夹在淀粉链之间,从而形成新的低序或无序的晶体结构,这与红外光谱和拉曼光谱的分析一致。

2.5 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物红外光谱分析

不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的红外光谱分析结果如图4a所示,与对照组相比,在糯米淀粉中添加β-葡聚糖后各个吸收峰没有明显的变化,并未出现新的吸收峰,这表明多糖和淀粉的聚合方式可能为物理镶嵌或附着[24]。糯米淀粉复合物在3 700～3 100 cm-1处形成一个宽峰,这是大分子物质间典型的羟基缔合峰。随着β-葡聚糖添加量的增加,光谱带在3 415 cm-1处的O—H拉伸峰变宽,表明淀粉和β-葡聚糖分子间存在较强的氢键相互作用[25]。根据Chi等[12]研究,1 047 cm-1/1 022 cm-1的强度比已被用来反映更多结晶区域的有序度,吸光度1 022 cm-1/995 cm-1的比率可以衡量淀粉中无定形与有序结构的比例。因此用吸光度比1 047/1 022 cm-1(R1 047/1 022)和1 022/995 cm-1(R1 022/995)用于量化阶数,表征其淀粉的短程有序结构,如图4b去卷积图所示。由表2可知,随着β-葡聚糖添加量增加,R1 047/1 022值从0.851下降到0.716,R1 022/995值从1.091增加到1.354。这表明球磨处理中,淀粉分子间的相互作用在巨大机械力的作用下被破坏,导致短程有序结构和双螺旋结构的解体,使淀粉复合物的短程有序性降低[26]。同时,由于葡聚糖存在,二者的相互作用可能会加速了淀粉短程有序结构的无序化,这与XRD的分析结果一致。

图4 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的红外光谱

2.6 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的糊化特性分析

对照组糯米淀粉和不同添加量糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的黏度特征值如表3所示,随着β-葡聚糖的加入,复合物淀粉的峰值、谷值和终值黏度均呈下降趋势,随着β-葡聚糖添加量的增加,这种现象逐渐明显。这可能是因为水溶性的β-葡聚糖黏度比糯米淀粉低,添加量的比例越大,使复合物的特征黏度下降。同时,球磨处理破坏的了淀粉的结晶结构,短程有序性逐渐无序化,导致复合物黏度曲线的特征黏度值越小。此外,在糊化过程中,葡聚糖粘附在淀粉颗粒上,抑制了其糊化过程,提高了糊化温度[6]。回生值(SB)代表短期老化的程度。随着β-葡聚糖添加量的增加,回生值逐渐减小。这表明随着β-葡聚糖的添加,糯米淀粉复合物的短期老化受到抑制。这可能是由于在球磨处理下,β-葡聚糖和直链淀粉分子的连接比直链淀粉分子之间的再聚集更强,导致回生值降低[6]。换言之,可能是由于β-葡聚糖与淀粉羟基结合形成氢键,减少了淀粉分子链自身的重新排列[14]。相较于质量分数5%葡聚糖,当质量分数为20%时,糯米淀粉复合物的糊化时间、糊化温度下降。这主要是因为研磨和葡聚糖的存在会加速淀粉复合物结晶结构的破坏,分子链的断裂,相对结晶度显著下降。这与Liu等[27]研究球磨处理糯米淀粉的结果一致。

表3 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的黏度特征值

2.7 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的流变学特性分析

2.7.1 动态黏弹性分析

损耗模量(G″)代表样品的黏性行为,衡量整个过程中黏性耗散变形引起的能量损失。储能模量(G′)代表样品的弹性行为,表示为储存在原料或各变形周期的可恢复量度[28]。G′是反映淀粉浆动态流变特性和表征淀粉浆弹性的主要参数[29]。糯米淀粉复合物的G′和G″随角频率的变化如图5a和图5b所示。其复合物的G′和G″随着角频率的增加而增加,G′值始终大于G″值。这说明该凝胶体系主要为弹性性质,表现出典型的弱凝胶行为[28]。所有复合物的G′值均低于对照组糯米淀粉,且G′值随着β-葡聚糖添加量的增加而降低,说明β-葡聚糖可显着降低糊化淀粉的弹性。此外,虽然所有的G″值均低于对照组,但其趋势不如G'明显,tanθ值随着β-葡聚糖添加量的增加而增加。因此,β-葡聚糖对糊化糯米淀粉的影响更多的是对弹性的影响,这可能是因为冷冻球磨过程导致的淀粉颗粒分子间和分子内氢键的破坏,使得β-葡聚糖与淀粉分子结合,改变其构象,进而影响淀粉的变化,尤其是支链淀粉的糊化,限制了淀粉的膨胀和淀粉分子的释放[30]。另一方面,可能是由于β-葡聚糖可以抑制糯米淀粉中直链淀粉形成连续网络结构。β-葡聚糖和浸出直链淀粉的连接,减少了直链与直链淀粉的相互作用,导致直链淀粉再聚集延迟,淀粉糊弹性降低[6]。

图5 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的动态、静态流变图

2.7.2 静态剪切流变特性分析

从图5可以看出,随着β-葡聚糖的加入,复合物的表观黏度随着剪切速率的增加而降低。这表明糯米淀粉复合物具有假塑性流体的特性。此外,不同添加量的β-葡聚糖,糯米淀粉复合物的表观黏度随添加量的增加而降低。β-葡聚糖越高,其复合物的表观黏度越低,这与RVA的结果是相一致的。这可能是因为β-葡聚糖与淀粉的交联作用相对较弱[31],水胶体和水分子不能更好地结合,从而出现这种现象。Ji等[32]研究表明羧甲基壳聚糖的加入,对其表观黏度也出现下降趋势,与本研究的结果相一致。由糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的的剪切应力曲线所示,剪切应力随着剪切速率的增加而逐渐增加。样品的所有流动行为指数(n)均低于1,这表明复合物均表现出假塑性行为[33]。根据Power Low模型拟合得到稠度系数(K)、流动行为指数(n)和决定系数(R2)如表2所示。添加β-葡聚糖后,复合物的稠度指数(K)降低,且K值随着β-葡聚糖浓度的增加而降低,这表明稠度系数与流体黏度呈负相关。糯米淀粉中添加的β-葡聚糖越多,随着剪切速率的提高,所需的剪切应力越小,进一步证明β-葡聚糖可以降低糊化糯米淀粉的凝固度,降低糊化糯米淀粉的黏度。

2.8 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的消化性分析

糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的功能淀粉含量如表4所示,β-葡聚糖对糯米淀粉的RDS、SDS和RS含量有较大的影响。随着β-葡聚糖添加量的增加,RDS的质量分数从75.75%下降到63.06%,RS质量分数从12.58%增加至31.40%,血糖指数pGI显著降低。这表明β-葡聚糖可以降低糯米淀粉的消化率,调节血糖反应水平。这可能是由于β-葡聚糖与糯米淀粉在冷冻球磨处理过程中相互作用,形成空间位阻,阻碍消化酶与底物的接触,酶水解淀粉程度降低,从而促进RS的增加[6]。另有研究表明,α-淀粉酶的活性随着β-葡聚糖浓度的增加而降低,导致其消化率降低[34]。此外,糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的SDS的含量出现下降趋势,在20%的添加比时达到最小值。这种变化可能是由于添加了β-葡聚糖,导致直链淀粉和短支链淀粉之间的网络空间结构相互作用,使得一部分SDS转化为RS[35]。随着添加量的增加,其复合物的k值显著低于未处理对照组。C∞代表在反应结束时消化的淀粉的理论百分比,β-葡聚糖的加入明显降低了C∞值。

表4 不同添加量的糯米淀粉-β-葡聚糖复合物的RDS、SDS、RS含量和pGI及相关的消化率参数

3 结论

研究利用冷冻球磨技术制备不同β-葡聚糖添加量的糯米淀粉复合物,研究其复合物的理化特性、流变学特性和消化特性。结果表明,随着β-葡聚糖的增加,复合物的溶解度和膨胀度显著降低,粒径增加,复合体系出现不规则团聚现象。通过冷冻球磨处理,β-葡聚糖与糯米淀粉中直链和支链淀粉通过氢键相互作用,附着在淀粉颗粒表面,减少淀粉颗粒膨胀,抑制了直链淀粉和支链淀粉的浸出,降低其复合物的峰值黏度、谷值黏度、回生值、稠度系数K、G′和G″等,增强了体系的流动性和稳定性。在消化性方面,RDS含量显著下降,抗性淀粉的含量增加,血糖指数也下降。