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白喉产毒培养基中铁离子磺基水杨酸分光光度检测方法的建立及验证

2023-10-20温嘉纳李婧妍姬光廖宏玮李燕段维国何春艳孙明波顾琴

中国生物制品学杂志 2023年10期
关键词:产毒白喉水杨酸

温嘉纳,李婧妍,姬光,廖宏玮,李燕,段维国,何春艳,孙明波,顾琴

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所,云南昆明650118

白喉(diphtheria)是由白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)引起的急性呼吸道传染病。在不发达战乱频发国家或免疫率较低地区仍有流行传播风险[1-2],我国局部地区部分人群抗体浓度处于较低水平[3]。白喉毒素(diphtherotoxin)是白喉棒状杆菌主要致病因素,可致感染者呼吸道阻塞,甚至窒息死亡;毒素进入血液系统可引起全身中毒症状,部分患者出现心肌受损,成为白喉感染后期死亡原因。使用标准白喉产毒菌株进行培养,收获白喉毒素,制备疫苗免疫人群,是目前预防白喉最有效的手段[4]。

据文献报道,白喉棒状杆菌培养中,产毒过程与培养基中铁离子有关,毒素必须在低铁条件下生成[5-7],白喉棒状杆菌在含铁为0.14 mg/L 的培养基中毒素产量最高,铁浓度达0.6 mg/L 时,则完全不产毒[8]。因此,在疫苗研发过程中应建立合理、有效的方法检测培养基中铁离子含量。分光光度法是实验室检测痕量铁最常用的方法之一,相较于市售邻菲啰啉、菲啰嗪等铁检测试剂盒,磺基水杨酸分光光度法具有简便快捷、准确可靠、成本低等优点[9-12]。在氢氧化氨碱性(pH 8 ~11)介质中,铁离子与磺基水杨酸生成稳定的黄色络合物,该络合物的吸光度与样品中铁含量成正比,因此可采用分光光度法对样品中的铁离子含量进行测定[12]。根据该原理,本研究测定了铁-磺基水杨酸络合物特异性吸收峰,并参照《中国药典》三部(2020版)分析方法验证指导原则[13],建立白喉产毒培养基中铁离子含量检测方法,并对方法进行验证。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 硫酸铁铵[NH4Fe(SO4)2]·12H2O(分析纯)购自天津科密欧化学试剂有限公司;磺基水杨酸(C7H6O6S·2H2O,分析纯)购自天津博迪化工股份有限公司;氢氧化铵(分析纯)购自广东光华科技股份有限公司;牛肉胰酶消化液培养基为自制;多聚蛋白胨购自美国BD 公司,配制5%蛋白胨培养基;Sartorius BP211D 电子分析天平购自德国Sartorius 公司;ThermoscientificVarioskan LUX 多功能酶标仪购自美国Thermo Scientific公司。

1.2Fe3+标准溶液的配制及稀释 溶解0.431 7 g NH4Fe(SO4)2·12H2O 于10 mL 体积比1∶1 的盐酸溶液中,以注射用水为稀释剂(WFI)定容至500 mL,此溶液铁离子含量为100 µg/mL;使用96 孔板对Fe3+标准溶液(100 µg/mL)进行稀释,每孔终体积100µL,制备试验所需含量标准溶液。

1.3显色条件 20%磺基水杨酸显色剂15µL/孔,体积比1∶1氢氧化铵50µL/孔,室温显色10 min,以注射用水(WFI)为空白对照。

1.4反应物及铁-磺基水杨酸络合物全光谱扫描Fe3+标准溶液(100µg/mL)1∶3 稀释后加入显色剂反应,于多功能酶标仪上进行全光谱扫描,扫描范围为200 ~1 000 nm,步长1 nm,检测络合物特异吸收峰值;同时对参与反应的Fe3+标准溶液、20%磺基水杨酸、1∶1氢氧化铵进行全光谱扫描。

1.5标准曲线测定 制备Fe3+标准溶液(100、50、10、1、0.5、0.1、0.05、0.01 µg/mL),分光光度法测定A425值,确定线性回归关系。

1.6线性范围及检测限的确定 制备Fe3+标准溶液(1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.04、0.03、0.01µg/mL),分光光度法测定A425值,确定线性范围及检测限。

1.7标准曲线的验证 使用多功能酶标仪测定波长425 nm 处不同Fe3+含量(1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05µg/mL)A值,以A425进行线性回归,连续10 次绘制标准曲线,统计A425、R2值,评价建立标准曲线的成功率。

1.8方法的验证

参照《中国药典》三部(2020 版)9101 分析方法验证指导原则对建立的方法进行验证。

1.8.1稳定性 建立标准曲线后,每隔5 min 测定1次A425,连续测定8 次,计算变异系数(CV),验证方法的稳定性。

1.8.2准确性和精密性 配制高(1 µg/mL)、中(0.5 µg/mL)、低(0.05 µg/mL)含量的Fe3+溶液,测定铁离子含量,每个样品平行测定9组,重复3次,计算回收率和CV,验证方法的准确性和精密性。

1.9干扰性试验 根据DB 公司蛋白胨产品Poplypeptone 中Ca2+、Mg2+、K+、Na+离子含量配制4 种过量离子溶液,加入显色剂后检测A425值;分别检测15 µL磺基水杨酸(20%)和50 µL 氢氧化氨(1∶1)的A425值,以WFI 为空白对照。4 种过量离子溶液各配制3组样品,每组重复测定3次,判定干扰性试验结果。

1.10白喉产毒培养基中总铁含量及白喉毒素测定100 mL三角瓶中加入不同培养基(牛肉胰酶消化液、5%多聚蛋白胨),取样,活性炭脱色后检测铁含量,按白喉生产规程,接种细菌,于恒温箱中静止培养72 h 后停止培养,观察细菌生长情况,按照《中国药典》三部(2020 版)通则3506 类毒素絮状单位测定法检测细菌产毒量。3个批次每批次测定3次。

1.11磺基水杨酸分光光度法与常用铁含量检测方法的比较 分别采用磺基水杨酸分光度法及常用方法亚铁嗪比色法、邻菲啰啉分光光度法检测两种培养基(牛肉胰酶消化液、5%多聚蛋白胨)中铁含量,比较3种方法的检测结果。

1.12统计学分析 采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析,组间比较采用样品均值t检验,以P<0.05 为差异有统计学意义。准曲线方程为:Y= 0.027 9X+ 0.046 1,R2>0.99,见图3。

2 结果

2.1反应物及铁-磺基水杨酸络合物光谱扫描 光谱扫描发现,铁-磺基水杨酸络合物在425 nm 处有特异紫外吸收峰,参与反应物不对特异紫外吸收峰产生影响。见图1。

图1 反应物及络合物吸收光谱曲线Fig.1 Absorption spectrum curves of reactants and complex

2.2标准曲线测定 Fe3+(100 ~0.01 µg/mL)与磺基水杨酸生成的络合物与A425值呈直线回归关系,见图2,标准曲线方程为:Y= 0.027 9X+ 0.044,R2>0.99。表明可通过检测A425值测定Fe3+含量。

图2 铁-磺基水杨酸络合物标准曲线(0.05 ~100µg/mL)Fig. 2 Standard curve of iron-sulfosalicylic acid complex(0.05 ~100µg/mL)

图3 铁-磺基水杨酸络合物标准曲线(0.05 ~1µg/mL)Fig. 3 Standard curve of iron-sulfosalicylic acid complex(0.05 ~1µg/mL)

选取符合白喉产毒培养基中铁离子含量区间段进行测定:Fe3+含量在1 ~0.05µg/mL之间,与磺基水杨酸生成的络合物A425值呈直线回归关系,标

2.3铁-磺基水杨酸络合物的线性范围及检测限 试验结果显示,Fe3+(1 ~0.05µg/mL)与磺基水杨酸生成的络合物A425值从高到低,线性良好。但Fe3+含量低于0.05 µg/mL 后,A425值趋同于WFI(0.046 3),见图4。综合考虑确定利用铁-磺基水杨酸络合物的A425值测定铁离子含量的线性范围为1 ~0.05µg/mL,检测限为0.05µg/mL。

图4 铁-磺基水杨酸络合物吸光度值Fig.4 Absorbance values of iron-sulfosalicylic acid complex

2.4标准曲线的验证 验证结果显示,标准曲线满足以下条件时,试验结果可靠:1µg/mL Fe3+标准品A425≥0.073;0.05 µg/mL Fe3+标准品A425≥0.047;标准曲线R2>0.99。连续10 次测定结果表明,绘制的标准曲线符合条件,见表1。

表1 标准曲线的验证结果Tab.1 Verification results of standard curve

2.5方法的验证

2.5.1稳定性试验结果显示,建立标准曲线后,每隔5 min 测定1 次A425值,A425值随时间的增加有波动趋势,但幅度较小,且各浓度标准品A425值的CV均小于5%,见表2。表明标准品显色后40 min内稳定。

表2 稳定性试验结果Tab.2 Results of stability test

2.5.2准确性和精密性 试验结果显示,低、中、高浓度Fe3+标准品溶液连续测定3 次,每个浓度平行测定9组的CV均<5%,回收率均>95%,见表3。表明该方法准确性较高,精密性良好。

表3 准确性和精密性试验结果Tab.3 Results of accuracy and precision test

2.6干扰性试验 4 种过量离子溶液、15 µL 磺基水杨酸(20%)和50µL 氢氧化氨(1∶1)A425值均小于空白对照,不对检测方法构成干扰。见表4。

表4 干扰性试验结果Tab.4 Results of disruptive test

2.7白喉产毒培养基中铁含量及细菌产毒情况 牛肉胰酶消化液培养基中铁含量平均值为0.09µg/mL,培养物检测到毒素;而铁含量较高的5%多聚蛋白胨培养基细菌能够生长但不产毒。两种培养基中铁含量差异有统计学意义(t= -63. 694,P<0.05)。见表5。

表5 白喉产毒培养基中铁含量与细菌产毒统计Tab.5 Statistics of iron content in diphtheria toxin producing medium and bacterial toxin production

2.8磺基水杨酸分光光度法与常用铁含量检测方法的比较 3 种检测方法结果一致,见表6。表明磺基水杨酸分光光度法可用于培养基中铁含量检测。

表6 不同方法的检测结果Tab.6 Results of different detection methods

3 讨论

本实验对铁-磺基水杨酸络合物光谱扫描表明,该络合物在425 nm处有最大特异紫外吸收峰,因此可通过检测425 nm 处的吸光度值来测定铁离子含量。根据适合白喉杆菌产毒条件的铁离子含量,课题组研究了Fe3+浓度与铁-磺基水杨酸络合物A425值的关系,确定线性范围为1 ~0.05 µg/mL,检测限为0.05 µg/mL;参照《中国药典》三部(2020 版)《分析方法验证指导原则》对建立的磺基水杨酸分光光度法进行了稳定性、准确性、精密性验证,结果表明,该方法稳定性高、准确性和精密性良好。实验通过对自制及市售培养基中铁含量的检测及细菌产毒结果比较,得到与亚铁嗪比色法及邻菲啰啉分光光度法一致的检测结果,验证了在低铁含量培养基中白喉杆菌可以产毒,但产毒量与铁含量之间的关系仍值得探讨。

《中国药典》中铁离子检测方法有硫代硫酸钠滴定法、分光度计比色法以及电感耦合等离子体质谱法,但均存在一定的局限性。滴定法由人员进行反应终点判断,不同人员操作存在误差可能,且该方法操作繁琐,不利于对多个样品的检测;传统的分光度计比色法虽然结果准确,但同样存在操作繁琐、检验量少、所需样品量大等弊端;电感耦合等离子体质谱法用于中药样品中多元素的同时测定,但由于投入成本高,不利于推广。课题组使用96 孔板、多功能酶标仪建立的磺基水杨酸分光光度法测定培养基中微量铁含量,具有检测速度快、操作简便、样品微量、一次可检测多个样品、结果准确、成本低等优点。

终上所述,本实验建立了磺基水杨酸分光光度法测定培养基中微量铁含量,该方法快速简便,经初步方法学验证表明,可用于白喉产毒培养基中铁离子含量检测。

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