端粒酶活性多重荧光定量PCR（Taqman探针）检测方法的建立及验证

董莉，姜婷婷，周宇荀，李凯，肖君华

东华大学化学化工与生物工程学院，上海201620

端粒酶催化亚基（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶活性表达的关键组分，其编码的mRNA水平与端粒酶活性一致［1-2］，因此，可以用TERT 的mRNA 水平来衡量端粒酶活性［3-4］。近年，细胞治疗及基因治疗得到快速发展［5］，为更全面规范化控制细胞质量，可将端粒酶活性检测作为细胞成瘤性风险的评估标准，以提高细胞的生物安全性［6-7］。

目前，国内外有多种检测端粒酶活性的方法，如重复片段扩增（telomeric repeat amplification protocol，TRAP）法和TRAP-银染法［8-10］，这些方法是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示6 个碱基差异的条带来反映端粒酶活性，但由于步骤繁琐，成本高且存在放射性污染，已较少使用。另外，有厂家研发了SYBR Green实时荧光定量法，可间接测定端粒酶活性［11］，但由于TERT基因表达量较低，导致Ct值波动性大，无法准确定量，且易受引物二聚体的干扰，使溶解曲线不稳定，结果存在一定的孔间差异和非特异性扩增，造成假阳性干扰［12-13］。因此，亟需建立一种具有高反应特异性、灵敏性及可对细胞基因进行精确定量的检测方法。本研究通过优化逆转录引物、TERT基因的定量引物和探针，并引入内参GAPDH基因，在单管中利用荧光定量PCR（Taqman 探针法）进行多重反应，提高反应特异性和灵敏性［14］，同时验证方法的稳定性及重复性，以期应用于临床诊断和生物医药领域的评估检测。

1 材料与方法

1.1细胞株 293T和MRC-5细胞由中国科学院干细胞库提供；18 份正常间充质细胞样本和32 份乳腺癌细胞样本均由无锡翼和生物有限公司提供。

1.2主要试剂及仪器 Trizol 试剂购自日本TaKaRa公司；Probe qPCR Super Mix 购自苏州近岸蛋白科技有限公司；逆转录试剂盒Termo scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit及NanoDrop微量分光光度计购自美国Thermo公司；7500 Real Time PCR System购自美国Applied Biosystems公司。

1.3引物及探针设计 根据NCBI 中登录的TERT（7015）和GAPDH基因（2597）的CDS 序列，参照引物和探针的设计原则，应用Oligo 6.0 软件在CDS 序列3'末端设计特异性逆转录引物（RT-TERT 及RTGAPDH）。应用Snap gene 3.2.1软件设计1对GAPDH基因定量引物（GAPDH-1-F／R）和探针（GAPDH-1-P）；设计TERT基因的2 对定量引物（TERT-1-F／R 及TERT-2-F／R）和FAM 荧光标记的探针（TERT-1-P及TERT-2-P），每对扩增产物长度约为200 bp。逆转录引物由美国Thermo 公司提供，定量引物及探针均由苏州泓迅生物科技有限公司合成。见表1。

表1 TERT和GAPDH基因的引物及探针序列Tab.1 Primer and probe sequences of TERT and GAPDH genes

1.4方法的建立 荧光定量PCR 反应体系为：cDNA 2µL，Taq Man Multiplex qPCR buffer 10µL，ROX dye Ⅱ0.4µL，20µmol／L的TERT定量引物（F／R）各0.3µL，10µmol／L探针0.4µL，加入ddH2O至20µL。采用7500 Real Time PCR System 进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃5 min；95 ℃15 s，58 ℃1 min，72 ℃30 s，72 ℃采集荧光信号，共46个循环。

1.5荧光定量PCR 反应体系的优化 用Trizol 试剂提取MRC-5细胞RNA，在特异性逆转录引物（RT-TERT和RT-GAPDH）和随机引物作用下，通过逆转录获得两种荧光定量所需的cDNA；分别以两种cDNA 为模板进行多重荧光定量PCR 反应，方法同1.4 项。按定量引物的不同分为3 组：①TERT 第1 对定量引物及探针（TERT-1-F、TERT-1-R和TERT-1-P）与内参引物（GAPDH-1-F、GAPDH-1-R和GAPDH-1-P）作用进行双重荧光定量；②TERT第2对定量引物探针（TERT-2-F、TERT-2-R 和TERT-2-P）与内参引物（GAPDH-1-F、GAPDH-1-R 和GAPDH-1-P）作用进行双重荧光定量；③将TERT两对定量引物及探针混合后与内参引物进行3 重荧光定量（两种荧光）。以最小Ct值和较高荧光信号量（ΔRn）为最佳引物［15］。

1.6端粒酶阳性标准品及阴性标准品的制备 用Trizol

试剂提取293T 细胞RNA，逆转录为cDNA，将cDNA用超纯水进行2 倍稀释（初始浓度）后，再依次稀释为7.5、3.75、1.88、0.94和0.47 ng／µL 5个浓度，各取2 µL，采用优化方法进行检测，重复检测3 次，应用ABI 7500 软件生成标准曲线。另用Trizol 试剂提取MRC-5细胞RNA，相同方法制备端粒酶阴性标准品。

1.7方法的验证

1.7.1稳定性 取10 µL 端粒酶阳性标准品cDNA，加入等体积分数的TE（Tris-EDTA buffer solution）缓冲液，置50 ℃烘干过夜；加入20µL 的超纯水复溶，-20 ℃反复冻融3及5次，每次至少冻融12 h以上，取2 µL 作为模板，按优化方法进行检测，重复检测3次，以未冻融的样本为对照。比较反复冻融后的阳性标准品中TERT与GAPDH基因之间的△Ct，评价标准品的稳定性。

1.7.2精密性 以阳性标准品cDNA 为模板，采用优化方法进行检测，每个浓度平行检测3次，计算批内CV。将上述条件进行3次独立重复试验，计算批间CV。

1.8方法的应用 取19份正常间充质细胞样本和32份乳腺癌细胞样本，用Trizol 试剂提取细胞RNA，反转录为cDNA，以其为模板，采用优化方法进行检测，每个样本重复检测3次。

1.9统计学分析 应用GraphPad Prism 9软件进行统计学分析，试验数据以均值±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1最佳荧光定量PCR 反应体系 ①组试验结果显示，在特异性逆转录引物和随机引物作用下，TERT基因均可获得较好的扩增曲线，但后者△Rn比前者低约1.5 倍，且TERT基因的Ct值约为25.2；②组试验结果与①组相似；③组试验结果显示，与随机引物比较，在特异性逆转录引物作用下，TERT基因的扩增效率和检测的灵敏度均大幅提高，且△Rn提高了约3 倍。见图1。因此，确定以特异性逆转录引物合成的cDNA 为模板，将TERT两对定量引物和探针混合后与GAPDH引物及探针进行多重荧光定量PCR（Taqman 探针法）检测，可大幅提高检测的灵敏度、特异性及TERT基因的荧光信号量。

图1 荧光定量PCR反应体系的优化Fig.1 Optimization of fluorescence quantitative PCR reaction system

2.2阳性标准品的制备 5 个浓度梯度的阳性标准品TERT及GAPDH基因的Ct值分别为23～27 及15～19，TERT基因扩增曲线正常，且与GAPDH基因之间的△Ct保持稳定，见图2。确定制备标准品的端粒酶活性为阳性。且TERT和GAPDH基因的Ct值与样本量对数呈良好的线性关系，见图3。

图2 阳性标准品TERT和GAPDH基因的扩增曲线Fig. 2 Amplification curves of positive standard TERT and GAPDH genes

图3 阳性标准品TERT和GAPDH基因的标准曲线Fig.3 Standard curves of positive standard TERT and GAPDH genes

2.3阴性标准品的制备 5个浓度梯度的阴性标准品中，GAPDH基因扩增曲线正常，无TERT基因扩增曲线，且Ct值均＞35，见图4。确定制备的阴性标准品的端粒酶活性为阴性。

图4 阴性标准品GAPDH基因的扩增曲线Fig. 4 Amplification curves of negative standard GAPDH gene

2.4方法的验证

2.4.1稳定性 反复冻融3 及5 次阳性标准品中，TERT与GAPDH基因之间的△Ct与未冻融的阳性标准品比较，差异较小，△Ct均保持在8.0～8.6之间，见图5。表明该方法具有良好的稳定性。

图5 稳定性验证结果Fig.5 Verification for stability

2.4.2精密性 以阳性标准品的cDNA为模板，Ct的批内CV为0.08%～0.75%，Ct的批间CV为0.12%～0.63%，均＜1%，见表2。表明该方法具有良好的精密性。

表2 精密性验证结果（±s，n=3）Tab.2 Verification for precision（±s，n=3）

表2 精密性验证结果（±s，n=3）Tab.2 Verification for precision（±s，n=3）

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2.5方法的应用 19 份正常间充质细胞样本TERT基因的Ct值均未检测出或＞35，且GAPDH基因的Ct平均值为18，表明端粒酶活性均为阴性；32 份乳腺癌细胞样本TERT基因Ct值均＜35，有良好的扩增曲线，表明端粒酶活性均为阳性。见图6。且TERT与GAPDH基因之间的△Ct保持稳定，符合预期要求。19 份正常间充质细胞样本与32 份癌细胞样本的TERT基因的Ct值差异有统计学意义（t=4.236，P＜0.001），GAPDH基因的Ct值差异无统计学意义（t=0.597，P＞0.05）。见图7。

图6 间充质细胞（A）及乳腺癌细胞样本（B）的扩增曲线Fig. 6 Amplification curves of mesenchymal cell（A）and breast cancer cell samples（B）

图7 间充质细胞及乳腺癌细胞样本TERT 及GAPDH 基因的Ct值Fig. 7 Ct values of TERT and GAPDH genes in mesenchymal cell and breast cancer cell samples

3 讨 论

常用于分析端粒长度的细胞类型主要是血淋巴细胞和其他单核细胞，通常称为外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）［16］，这些细胞被激活时能够上调端粒酶活性。肿瘤发生过程中，端粒酶活性高度上调，在大多肿瘤组织中，端粒酶活性较高。这种活性升高的状态使端粒长度得以维持，即使在肿瘤细胞中端粒长度较短，也能使细胞无限期生长［17-18］。因此，通过检测端粒酶活性可快速判断正常细胞是否转变为肿瘤细胞，可用于早期肿瘤的诊断。

MRC-5 细胞是14 周龄男性胎儿正常肺细胞，免疫原性好，有良好的耐受性，可选作阴性标准品［19］。由于TERT在正常细胞中的表达量较低，使端粒酶活性检测变得困难，为解决该问题，有研究建立了一种荧光定量PCR 与TRAP 结合的检测方法，用该方法检测13例淋巴瘤样本，虽然比TRAP法灵敏度高9倍，但无法避免延伸引物的二聚体干扰和TRAP法带来的放射性污染，且该方法的精密性验证CV约为5%［20-21］。本研究对TERT基因的定量引物和探针进行了优化，将2对同一种荧光的探针进行合并后与GAPDH基因在单管中利用Taqman 探针法进行多重定量PCR 反应，不仅安全高效，还在一定程度上避免了孔间差异和产物非特异性扩增，且CV均＜1%，更能稳定、灵敏地检测端粒酶活性。OU等［22］为避免TRAP法扩增后的繁琐步骤（如聚丙烯酰胺凝胶电泳），设计了一种基于氧化石墨烯的核酸探针检测法，操作相对简单，但无法确保样本在不同批次检测结果的一致性和稳定性，不利于大量临床样本的检测。本研究将标准品反复冻融，采用建立方法进行检测，结果显示，TERT基因的扩增曲线正常，且与GAPDH基因的△Ct保持恒定，证明该方法具有良好的稳定性。YANG 等［23］利用TRAP 法对167 份胃黏膜样本进行端粒酶活性检测，结果显示，65份胃癌样本中阳性率达92.3%，57 份慢性萎缩性胃炎胃黏膜样本中阳性率为24.6%，45份正常胃黏膜样本中阴性率为100%。本研究检测的51 份样本中，乳腺癌细胞与正常间充质细胞中TERT与GAPDH基因之间的相对表达水平差异有统计学意义（P＜0.001），与相关文献报道癌细胞中具有较高端粒酶活性相符［18，24-25］。

综上所述，本研究建立的多重荧光定量PCR（Taqman 探针）法可稳定高效检测端粒酶活性，一定程度上改变了TERT基因的荧光信号量，提高了检测灵敏度。由于85%～98%的肿瘤细胞均存在端粒酶活性［25］，通过对端粒酶活性的筛查，可快速预判癌变风险。另外，端粒酶还可作为抗肿瘤的重要靶点［26］，有望成为未来生物医学和临床医学新的研究方向。