基于MAPK主要信号通路探讨动物抗菌肽免疫调控机制研究进展

徐晨露,夏 嫱

(遵义医科大学 珠海校区基础教学部,珠海 519041)

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs),又称宿主防御肽(host defense peptides,HDPs),是生物体内产生的一种具有较强抗菌活性的小分子多肽,具有多种免疫调节作用。抗菌肽最初从惜古比天蚕蛹内获得[1],后来又相继在细菌、植物、动物等所有生物体内发现[2]。动物抗菌肽通常由上皮细胞产生,可以从组织、血液、体液和体表等分离获得。此外,抗菌肽也可由各种免疫细胞,尤其是吞噬细胞产生,它们以颗粒形式存在于感染或炎症部位,当吞噬细胞内的抗菌肽受外界刺激产生并达到一定浓度时,吞噬细胞可将其释放,进而发挥免疫调控活性。因此,抗菌肽被认为是抵御病原体入侵机体的第一道防线[3]。研究表明,抗菌肽不仅可以通过调控炎症相关信号通路及其转录因子的表达来调节炎症反应,还对效应细胞具有趋化作用,诱导免疫细胞的招募和聚集,进而提高机体对细胞内、外病原微生物的杀伤力,促进免疫稳态[4]。关于抗菌肽免疫调控作用及机制研究引起科研人员的广泛关注[5-7]。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路是将细胞外刺激转化为细胞内反应的重要分子传感器,其激活可导致相关细胞内底物或靶标的磷酸化,参与细胞的增殖、凋亡、运动、发育及炎症反应[8]。目前关于MAPK信号通路的研究多集中在肿瘤领域,在抗菌肽免疫调控领域的研究还较少,尤其是基于MAPK信号通路研究抗菌肽免疫调控机制的综述还未见报道。本文综述MAPK主要信号通路在动物抗菌肽免疫调控机制中的研究进展,以期为抗菌肽机制的深入研究及抗菌肽在医药领域作用靶点研究提供参考。

1 MAPK信号通路

MAPK是一组能被多种细胞外物质激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,是将信号从细胞膜传递到细胞核的重要传递者,可将细胞外的刺激转化为多种细胞反应,在免疫应答中发挥重要作用[9]。MAPK信号通路包括MAPK激酶激酶、MAPK激酶和MAPK等3种激酶,这3种激酶能顺次激活并磷酸化下游蛋白如神经生长因子受体、非七激酶子同源物、快速加速纤维肉瘤(rapidly accelerated fibrosarcoma,Raf)-1等,建立一系列级联酶促反应,共同调节细胞的重要病理生理过程[10]。另外,MAPK信号通路根据MAPK的亚族不同,主要分为3个亚通路:c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路、细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular-signal regulated protein kinase,ERK)信号通路,这3条通路被认为是经典的MAPK信号通路,可以被不同细胞外信号激活,激活后通过磷酸化使活化的MAPK进入细胞核,产生不同的生物学效应,与许多疾病的发生发展密切相关[11]。

1.1 JNK信号通路

JNK信号通路在将细胞外刺激传递至细胞核时起着至关重要的作用,可被多种免疫刺激激活。通过影响基因表达、细胞生存/死亡途径等来调控机体代谢、免疫应答、细胞生长、增殖、分化和凋亡过程。JNK不仅能被其底物c-Jun激活,也能被双特异性激酶MKK4和MKK7的酪氨酸(Tyr)、苏氨酸(Thr)残基磷酸化激活,被激活的JNK磷酸化下游转录因子以及其他非转录因子,使刺激在细胞质中发挥作用,或者从细胞质重新定位到细胞核中[12-13],绝大多数JNK通路不能独立完成信号的转导,需要与p38 MAPK、ERK通路互相协作才能完成[14]。

1.2 p38 MAPK信号通路

p38 MAPK信号通路在调节炎症反应中发挥重要作用,广泛存在于各种真核生物中。研究表明,各种环境应激、趋化因子和炎症因子均可通过MAPK的3种激酶激活p38 MAPK[13],而MKK3和MKK6则可以特异性磷酸化并激活p38 MAPK[11]。p38 MAPK不仅参与免疫细胞活化、炎症因子释放、细胞分化、增殖和凋亡等过程,还可以通过调节核转录因子-κB参与炎症反应,活化的p-p38 MAPK通过激活转录因子促进肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8等炎症因子的分泌,进而导致炎症反应发生,发挥免疫调控作用[15]。

1.3 ERK信号通路

ERK信号通路是最早被发现的MAPK通路,该通路最经典的为大鼠肉瘤(rat sarcoma,Ras)-丝裂原活化蛋白激酶信号通路。Ras是Raf-丝裂原活化细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)-ERK通路的一个上游蛋白。在Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通路中,被激活的Raf结合并磷酸化高度同源的双特异性激酶MEK1/2,通过磷酸化Tyr-Glu-Thr(TEY)调控位点激活下游的MEK,被激活的MEK通过其N端直接与ERK进行相互作用,催化ERK亚功能区的Tyr和Thr残基双特异性磷酸化,进而激活ERK,被激活的ERK被转运到细胞核中,促进细胞质靶蛋白磷酸化或者调节其他蛋白激酶的活性,进一步磷酸化下游底物,并最终通过调节多种转录因子的活性和基因表达向细胞核传递细胞增殖与分化的信号[9,13],参与调控细胞的增殖、侵袭及存活等多种细胞功能[16]。现已证实ERK通路过度激活可诱发癌症、炎症、神经障碍及发育障碍等[17]。

2 基于MAPK通路的免疫调控机制

抗菌肽作为天然的免疫效应分子,是动物固有免疫的重要组成部分,在免疫系统中发挥重要作用[18]。抗菌肽介导广泛的免疫功能,有助维持机体平衡,提高免疫能力,增强机体对病原微生物的杀灭效果[4,19]。其在哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类、昆虫类、甲壳类等动物中均有发现,当病原体入侵机体时,动物抗菌肽可以通过启动MAPK信号通路来发挥其免疫调控作用,现已发现ERK、JNK、p38 MAPK等3个MAPK亚通路参与了动物抗菌肽的免疫调控作用[9]。哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼类抗菌肽主要通过抑制或激活MAPK信号通路发挥免疫调控作用;而两栖类、昆虫及甲壳类抗菌肽则主要通过抑制MAPK信号通路发挥作用,具体见图1。

图1 动物抗菌肽免疫调控机制

2.1 哺乳动物抗菌肽

哺乳动物黏膜层的阳离子抗菌肽具有广谱抗菌活性,分为防御素(Defensin)和导管素(Catheclicidins)两大类,可有效防止有害微生物对动物的危害[20]。如羊β-防御素-2(SBD-2)通过激活MAPK信号通路,使p38、ERK1、JNK表达水平增加,从而影响大肠杆菌F17对羊肠上皮细胞(OIECs)的黏附,进而增强宿主感染大肠杆菌F17的先天免疫力[21];基于牛血红蛋白抗菌肽P3改造的抗菌肽JH-3,可以通过抑制p38 MAPK信号通路降低p38 mRNA的表达,减少IL-2、IL-6、TNF-α的表达和分泌,从而显著抑制沙门氏菌感染小鼠的死亡率和肠道炎症反应[22];来源于猪乳铁蛋白的抗菌肽LFP-20通过抑制MAPK信号通路,降低JNK、p38磷酸化水平,从而剂量依赖性地降低TNF-α、IL-6和IL-1β的表达,进而抑制脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的炎症反应[23];人类抗菌肽HBD-1可通过降低ERK、p38的磷酸化水平,下调促炎基因的mRNA表达和抑制炎症介质的产生,进而减轻炎症反应,促进牙髓组织的再生[24]。小鼠导管素类抗菌肽CRAMP作用于MAPK信号通路,亦可使ERK、JNK、p38磷酸化水平降低,IL-1β、IL-10分泌量减少,在宿主抵抗鲍曼不动杆菌肺部感染中发挥重要作用[25]。人抗菌肽LL-37也属于导管素类抗菌肽,但其是通过激活ERK、JNK信号通路增加ERK1/2、JNK磷酸化水平,降低IL-1β、TNF-α的表达,抑制LPS诱导的炎症反应,进而促进骨髓基质细胞的成骨分化[26]。

2.2 鸟类抗菌肽

鸟类仅表达β防御素,称为禽β防御素(Avian Beta-Defensins,AvBDs)。迄今为止,已鉴定出14种AvBD[27],均具有广谱抗菌活性[28]。鸡β-防御素5(AvBD5)通过磷酸化p38、ERK1/2激活MAPK信号通路,使鸡巨噬细胞的IL-1β、IFN-γ、IL-12p40、IL-10、IL-4等表达显著增加,起到免疫调节作用[29]。来源于鸡的β-防御素8(AvBD8)通过磷酸化ERK1/2和p38信号分子,激活MAPK信号通路,诱导 IL-1β、IFN-γ和趋化因子的表达,进而调节免疫应答[30]。从鸽子体内提取的抗菌肽Cl-CATH2可以显著抑制p38、ERK1/2、JNK1/2磷酸化水平,进而调节TNF-α、IL-6、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及IL-10的表达,从而调控先天性免疫应答[28]。

2.3 爬行类动物抗菌肽

爬行类动物具有先天性和适应性免疫应答,但主要依赖前者,由抗菌肽介导的先天性免疫应答可在宿主抵御感染中发挥重要作用[30]。研究表明,金环蛇抗菌肽Aathelicdin-BF可显著激活MAPK信号通路,诱导ERK、p38、JNK的磷酸化,进而促进单核细胞和中性粒细胞趋化因子的分泌,使其向感染部位聚集,显著增强小鼠体内抗金黄色葡萄球菌感染的能力[31]。来源于暹罗鳄亮氨酸(Leucrocin)I修饰而成的抗菌肽KT2亦可通过抑制MAPK信号通路,下调p-JNK、p-c-Jun、p-p38的蛋白表达,从而抑制人类皮肤黑色素瘤细胞的迁移和侵袭[32]。眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30则通过显著激活p38 MAPK信号通路降低TNF-α、IL-6分泌,从而治疗脓毒症小鼠[33]。来源于缅甸蟒蛇的抗菌肽CATHPb1亦通过抑制MAPK通路中p38、JNK1/2、ERK1/2的磷酸化,减少促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6产生及提高趋化因子MCP-1和抗炎细胞因子IL-10水平,有效保护小鼠免受多种病原体感染[34]。来源于扬子鳄的抗菌肽As-CATH4～As-CATH6均可通过抑制NO、TNF-α、IL-1β、IL-6的表达来发挥抗炎作用,但As-CATH4和As-CATH5是通过阻断MAPK信号通路的激活,抑制ERK和p38磷酸化,而As-CATH6仅抑制ERK磷酸化[35]。

2.4 两栖类动物抗菌肽

来源于两栖类动物的抗菌肽是两栖类免疫系统的重要成分,在抵御微生物入侵中发挥重要作用。首次从树蛙中分离的抗菌肽Cathelicidin-PP通过阻断MAPK信号通路激活,显著抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞中ERK、JNK和p38的磷酸化,进而抑制NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,从而达到抑制LPS诱导炎症反应的目的[36]。在小弧斑姬娃皮肤中分离到的抗菌肽Cath-MH,可抑制小鼠肾脏、肝脏、肺脏中ERK、JNK、p38的磷酸化,使促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平降低,从而降低脓毒症小鼠的炎症反应,减少脓毒症小鼠的死亡率[37]。花姬蛙抗菌肽Brevinin-2MP亦通过抑制MAPK激酶的级联激活,降低ERK、p38、JNK磷酸化水平,进而显著降低LPS诱导的NO、IL-6、TNF-α的表达,从而发挥抗炎作用[38]。从贵州蝾螈皮肤中提取的抗菌肽TK-CATH,亦通过抑制LPS激活的MAPK信号通路,显著降低p38、JNK、ERK的磷酸化,有效抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的表达,进而发挥抗炎活性[39]。

2.5 鱼类抗菌肽

当细菌、病毒等入侵时,鱼类可分泌多种不同种类抗菌肽,参与宿主的防御反应[20]。研究发现,从斜带石斑鱼中提取的抗菌肽Epinecidin-1(Epi)通过抑制p38磷酸化,减少TNFα、IL-6、iNOS及IL-1β的表达水平,进而治疗小鼠内毒素血症[40]。来源于尼罗罗非鱼的抗菌肽罗非鱼鱼苷4(TP4)通过增加ERK、p38活性来激活MAPK/ERK途径诱导的IL-10-STAT3信号传导通路,从而降低iNOS、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β等细胞因子的表达,进而抑制加德纳菌诱导的巨噬细胞炎症反应,降低细菌性阴道炎患者感染其他性传播疾病的风险[41]。

2.6 昆虫抗菌肽

昆虫抗菌肽是一种分子量低、热稳定性高、无免疫原性的化合物[42],主要分为五大类:天蚕素类、防御素类、溶菌酶、富含脯氨酸类和富含甘氨酸类[20]。昆虫抗菌肽可从昆虫的血淋巴、血细胞、吞噬细胞和上皮细胞中获得[2]。来源于双叉犀金龟的抗菌肽Allomyrinasin,可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的MAPK通路磷酸化,使p38、ERK、JNK磷酸化水平降低[43]。来源于粪甲虫的抗菌肽Coprisin,通过阻断LPS诱导RAW264.7细胞中酪氨酸和苏氨酸磷酸化水平,抑制p38 MAPK的活化,进而促使Coprisin通过p38 MAPK通路参与炎症反应[44]。来源于美洲大蠊的抗菌肽Periplanetasin-5通过抑制MAPK通路,显著降低LPS诱导的p38、ERK和JNK的磷酸化水平,以及抑制NO、环氧合酶(cyclooxygenase,COX)-2、TNF-α和IL-6的产生,进而发挥显著的抗炎作用[42]。桑树黄星天牛抗菌肽Psacotheasin-2通过MAPK信号通路,降低TNF-α、IL-6、IL-β以及iNOS、COX-2等的表达,以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应[45]。

2.7 甲壳类抗菌肽

甲壳类抗菌肽主要来源于虾、蟹等甲壳动物的血细胞和血浆,在免疫系统中发挥重要作用[46]。从虾中提取的抗菌肽SALF通过抑制p38 MAPK和ERK信号通路,降低了TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1等的表达水平,从而对阴道毛滴虫引起的炎症反应进行调节,进而抑制其生长[47]。

3 展望

动物抗菌肽是机体天然防御系统的重要组成部分,具有趋化效应细胞、诱导趋化因子转录及分泌、抑制炎症反应、连接先天性和适应性免疫等多种免疫调节功能,使其成为新兴的抗炎及免疫药物替代品,具有广阔的应用前景。但是关于抗菌肽免疫调控机理的研究还不够深入,特别是基于MAPK信号通路的抗菌肽免疫调控作用机制研究还较少,从仅有的这些研究中不难发现,动物抗菌肽可以有效抑制或激活MAPK信号通路,降低促炎细胞因子的释放,进而调控宿主免疫反应,改善机体炎症。今后可在MAPK信号通路关键蛋白表达方面进一步深入研究,以探寻动物抗菌肽免疫调控的关键靶点,期望其能够在机体免疫功能调节及抗炎药物等医药领域发挥更大作用。