复发性流产患者胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1表达及意义#

徐丽伟 张圆圆 康乐 王杉杉 赵青竹

（河南大学第一附属医院妇科，河南 开封 475100）

复发性流产（Recurrent spontaneous abortion，RSA）指连续发生率两次及以上自然流产，其发生原因较复杂，可能与免疫、内分泌、遗传等因素有关，RSA对孕妇生理及心理均造成较大影响，临床需根据RSA患者情况准确判断其RSA发生原因并及时采取应对、治疗措施，降低流产风险，预防患者再次流产。

胎盘绒毛滋养细胞在胚泡侵袭子宫内膜、胎盘形成及孕期内分泌等存在重要作用，胎盘绒毛滋养细胞凋亡与胎盘生长发育密切相关。自噬为真核细胞基础代谢反应之一，可维持细胞动态稳定，辅助物质、能量再利用，参与妊娠各个时期的生理及病理过程，正常自噬对妊娠存在促进作用，但自噬过度会破坏细胞稳定，导致胎盘组织细胞、内皮细胞等损伤甚至凋亡，引发胚胎死亡及流产。胎盘绒毛滋养细胞微管相关蛋白轻链3（Light chain，LC3）能靶向定位于自噬体膜，参与自噬过程。自噬相关蛋白Beclin-1为自噬体形成的必须分子之一，监测胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平可反应胎盘绒毛滋养细胞自噬水平。

目前临床大多研究胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平与子痫前期的关系。因此，本次旨在分析RSA患者胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1表达及其意义，为临床防治RSA、降低流产率提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2021年1月至2021年12月河南大学第一附属医院收治的50例RSA患者及50例胚胎发育正常行人工流产者的临床资料。将RSA患者纳入RSA组，将人工流产者纳入人工流产组。

纳入标准：RSA组患者均符合RSA诊断标准[1]；月经正常，无肿瘤、畸形等生殖系统疾病；无糖尿病等内分泌疾病；夫妻双方染色体均正常；人工流产组均有正常妊娠、分娩史。排除标准：存在明确环境、遗传因素导致流产；人工流产组存在不良妊娠、分娩史；高龄产妇。

RSA组中年龄22～31 岁，平均26.52±2.33 岁；流产次数2～4 次，平均3.12±0.46 次；早期流产29 例，晚期流产21 例。人工流产组中年龄21～33岁，平均26.89±2.41 岁；妊娠次数2～4 次，平均3.08±0.42 次；分娩次数1～3 次，平均1.97±0.43次。本次研究经我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 样本采集

RSA组及人工流产组均在其清宫术后采集其胎盘绒毛滋养细胞，并使用等渗生理盐水漂洗其中血液，漂洗后放在冻存管内，放入-80 ℃环境下保存。

1.2.2 胎盘绒毛滋养细胞LC3检测

取出冻存的绒毛组织，加入细胞裂解液，在4℃条件下以10000 r·min-1转速离心10 min，取30 μL上层清液使用考马斯亮蓝法调整蛋白浓度，依次使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、电转膜至聚偏二氟乙烯膜、5%脱脂奶粉封闭1 h后，分别加入鼠抗人LC3Ⅱ、LC3I一抗，在4 ℃条件下放置过夜，然后使用缓冲盐水和洗涤剂洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，在室温下放置1 h，再次洗涤，洗涤后使用增强化学发光法试剂盒进行显影、定影，使用以色列DNR成像系统仪器分析蛋白条带灰度值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，以LC3Ⅱ/LC3I为LC3相对表达量。

1.2.3 胎盘绒毛滋养细胞Beclin-1水平检测

检测方法同胎盘绒毛滋养细胞Beclin-1水平检测，测定其蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 22.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±SD）表示，进行t检验；计数资料以例或率（n（%））表示，进行卡方检验；P＜0.05为差异有统计学意义。以Spearman分析模型分析相关性。组别赋值“RSA组”=1、“人工流产组”=0，计入二元Logistic回归模型，以胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平为协变量，得出预测概率，以预测概率为联合预测评估预测效能；将胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平及联合预测录入，绘制受试者工作曲线（Receiver operator characteristic，ROC），读取曲线下面积（Area under the curve，AUC）、置信区间（Confidence interval，95%CI）、敏感度、特异度、截断值。

2 结果

2.1 胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平

RSA组患者胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平显著高于人工流产组（P＜0.05），见图1、表1。

表1 胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平比较（± SD，n=50）

表1 胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平比较（± SD，n=50）

注：与人工流产组比较，*P＜0.05。

组别 LC3 Beclin-1 RSA组 1.43±0.31* 1.81±0.43*人工流产组 1.01±0.28 1.22±0.40

图1 胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平

2.2 胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平与RSA发生的相关性分析

经Spearman分析模型分析，胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平与RSA发生呈正相关（r=0.783，P=0.003；r=0.825，P=0.002）。

2.3 胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平预测RSA发生的预测价值分析

ROC曲线中，胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平预测RSA发生的AUC分别为0.862、0.862，截断值分别为1.29、1.43；联合预测的AUC为0.942，敏感度为92.00 %，特异度为86.00 %，见图2、表2。

表2 ROC曲线参数

图2 ROC曲线

3 讨论

RSA对孕妇身体造成较大伤害，且对孕妇及其家属心理也造成较大心理压力，RSA发生的影响因素较复杂，临床需判断RSA患者流产原因，并及时采取针对性治疗等应对措施，降低流产率，因此需研究影响RSA患者流产的影响因素。

胎盘生长发育情况直接影响孕妇妊娠，胎盘绒毛滋养细胞是胎盘组织生长发育及妊娠期内分泌的重要作用细胞之一，当胎盘绒毛滋养细胞自噬活性升高，使胎盘绒毛滋养细胞侵袭能力下降，从而导致胎盘着床较浅，引发流产。胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1均为自噬过程重要参与因子，其水平直接影响到自噬活性[2]。

本研究结果显示，RSA组患者胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平显著高于人工流产组；经Spearman分析模型分析，胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平与RSA发生呈正相关，提示胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1语RSA发生存在明显相关性。究其原因，Beclin-1蛋白为自噬发生的主要蛋白之一，可调节自噬前体的生成，引导其他相关蛋白转移至自噬体膜，并平衡胎盘绒毛滋养细胞自噬和凋亡[3]。LC3为自噬双膜蛋白，在前自噬泡、自噬泡膜表面均有存在，参与自噬体形成、生长过程，可反映自噬程度[4]。当胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平上升时，表示自噬程度升高，一方面过量自噬可能直接导致自噬性细胞死亡，另一方面过量自噬可降解生存素等抗凋亡因子的释放，引发胎盘绒毛滋养细胞凋亡，导致胎盘着床浅，孕妇发生流产。

并且，本研究通过ROC曲线显示，胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平预测RSA发生的AUC分别为0.862、0.862，截断值分别为1.29、1.43；联合预测的AUC为0.942，敏感度为92.00 %，特异度为86.00 %，说明当孕妇胎盘绒毛滋养细胞LC3≥1.29、胎盘绒毛滋养细胞Beclin-1水平≥1.43时，孕妇发生流产的风险极高。原因在于，当胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平异常升高时，发生病理性细胞凋亡，引起内皮细胞损伤，导致胎盘发育障碍以及内分泌等功能异常，引发流产[5]。因此临床可将胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平纳入筛选RSA早期诊断的靶向目标，及时采取针对性治疗措施，降低流产发生风险。

综上所述，胎盘绒毛滋养细胞LC3、Beclin-1水平与RSA发生存在明显相关性，且其用于早期诊断RSA发生具有较高预测价值，为临床防治RSA、降低流产率提供方向及参考依据。