肾穿刺样本冷冻切片的质量改进方法研究

朱国良，张晓岚，崔戈

肾穿刺样本冷冻切片的质量改进方法研究

朱国良，张晓岚，崔戈

湖州市第一人民医院病理科，浙江湖州 313000

提高肾穿刺样本冷冻切片肾小球切出率及切片优良率。选取2021年9月至12月湖州市第一人民医院28例临床患者肾穿刺组织，通过改进肾穿刺样本冷冻取材、包埋及切片等系列方法，提高肾穿刺样本冷冻切片肾小球切出率及切片优良率。改进法肾小球切出率（100%）显著高于传统法肾小球切出率（82.14%），差异有统计学意义（2=5.490，=0.026）；改进法冷冻切片优良率（96.43%）显著高于传统法冷冻切片优良率（71.43%），差异有统计学意义（2=8.347，=0.004）。通过改进方法，提高了肾穿刺样本冷冻切片肾小球切出率及切片优良率，有临床推广的应用价值。

肾穿刺样本；冷冻切片；改进方法

肾穿刺样本获取困难、弥足珍贵，其结构的完整性直接影响其病理诊断。传统肾穿刺冷冻切片技术难以保证每次截取的组织能够切出肾小球，有时需要多次重取组织。此外，包埋方式、温度和时间的控制对于保证切片质量非常关键[1-5]。本研究通过对组织预处理及对样本头预准备等一系列工作环节进行改进，较大程度地保证了肾穿刺样本冷冻切片的质量，现总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取湖州市第一人民医院2021年9月至12月的28例临床患者肾穿刺组织，穿刺空心针型号为16G，外径3mm，每例患者包含2～3条长度为1.0～2.0cm的穿刺组织，选两条组织，各取长约0.5cm用于免疫荧光检查的冷冻制片，分为改进组和传统组，两组样本分别应用改进方法与传统方法进行冷冻制片。本研究通过湖州市第一人民医院医学科研与临床试验伦理委员会审查（伦理审批号：2022121401）。

1.2 方法

1.2.1 组织截取 传统组：选择其中的一条肾穿刺组织，用切片刀由组织的一端切取0.2cm做电镜，再切取0.5cm左右做冷冻切片，其余组织做常规病理。改进组：肾组织皮质端颜色稍苍白，髓质端颜色稍红。分割组织时先借助手机摄像头的放大功能区分皮质端和髓质端，再用切片刀将组织由皮质端切取0.2cm做电镜，然后切取0.5cm左右做冷冻制片，其余组织做常规病理[6]。

1.2.2 样本头准备 传统组：冷冻切片机箱体温度设定为–21℃，将胶水滴加于样本托上，待胶水半凝固后放样本。改进组：冷冻切片机（徕卡1950）箱体温度设定为–17℃。在样本托上滴加适量胶水，使其成椭圆形后置于冷冻切片机速冻台上，待其冷却凝固，将样本头移至切片机机头上，使胶水的长轴与刀口垂直，然后对胶水进行第1次粗修，使胶水成为平整的平台。

1.2.3 肾穿刺组织包埋 传统组：将1段长0.5cm的肾穿刺组织包埋于半凝固状态的胶水中，尽量平放，随即迅速转移至速冻台使其凝固（图1A）。改进组：取下样本托迅速将0.5cm的组织平放在已粗修平整的胶水平台表面，使组织的长轴与胶水平台的长轴垂直，再用胶水完整覆盖组织，并沿胶水平台的长轴方向在组织上下两边适当添加胶水，随即迅速转移至速冻台使其凝固（图1B）。

1.2.4 冷冻切片操作 传统组：胶水凝固后将样本托固定于机头上，调节刀片与样本托的距离，缓慢粗修，观察穿刺组织的暴露情况。细修出组织后试染1张，显微镜下观察肾小球的情况。按本研究要求完成所需切片数，最后1张进行冷冻HE染色，对比起始切片中肾小球的数量及分布情况，确定荧光染色片的选择顺序。改进组：将样本托移至机头，保持与粗修时角度一致，锁紧并调节刀片与样本托的前后距离，到位后二次粗修。观察两次胶水间的落差控制粗修进度，修出组织完整切面后试染一张于显微镜下观察肾小球。按照本科室免疫荧光检测要求，连续切片，最后1张进行冷冻HE染色以对比切片质量，分析起始切片中肾小球数量及分布情况，确定荧光染色片的选择顺序。

1.2.5 显微镜下观察切片质量 两组切片同时进行HE染色后显微镜下观察，并记录切片质量。评价方法参照《简明病理学技术》[7]：切片完整、薄、厚薄均匀；细胞无收缩退变；组织无卷曲、折叠；组织有无碎裂、褶皱。以截取一次组织能成功切出肾小球的例数占总例数的比率作为肾小球切出率。以细胞无收缩，组织无卷曲、折叠、碎裂的切片数占总片数的比率作为切片优良率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行处理分析，计数资料采用例数（百分比）[（%）]表示，组间比较采用2检验，<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

切片质量：传统法组织碎裂、卷曲、与包埋剂分离，有胶水空洞；改进法组织平整、与包埋剂完全融合，无胶水空洞，见图2。

染色后镜下观察：传统法组织碎裂、结构不完整、折叠，染色尚清晰；改进法组织结构完整、无折叠，染色清晰，见图3。

改进法肾小球切出率为100%，传统法肾小球切出率为82.14%；改进法切片优良率为96.43%，传统法切片优良率为71.43%。改进法的肾小球切出率显著高于传统法肾小球切出率（2=5.490，=0.026）；改进法的切片优良率显著高于传统法切片优良率（2=8.347，=0.004）。

3 讨论

肾穿刺样本冷冻切片的质量直接关系到免疫荧光染色结果的优劣。肾穿刺样本一般直径较小，条数较少，但需要的冷冻切片数量却很多（15～18片），制作出高质量的冷冻切片具有较大难度。穿刺样本冷冻制片过程中经常出现以下问题：切片上肾小球不足或无肾小球；切片上组织断续不成条、不完整；切片上组织出现空洞；切片上组织卷曲、折叠；组织发脆，切片呈碎裂状及无法完整制片等。产生上述问题的原因与穿刺样本运送流程、组织冷冻温度、冷冻持续时间及制片技巧等有关[8-14]。

图1 传统法与改进法肾穿刺组织的包埋方式

A.传统组；B.改进组

图2 传统法与改进法肾穿刺组织的切片质量

A.传统组；B.改进组

图3 传统法与改进法肾穿刺组织的染色质量（HE染色，×20）

A.传统组；B.改进组

湖州市第一人民医院采用获取样本后立即用生理盐水湿润的纱布包裹，并放入保温冷藏箱中半小时内转运至病理科，技术员接收样本后，采用改进法分三步制片，有效保障切片上有肾小球及切片质量。

传统法未有效区分肾组织皮质和髓质，经常需要二次取组织再切片，不仅造成组织浪费，也增加了制片成本。本研究改进了组织截取方法，先借助手机摄像头的放大功能区分皮质和髓质，再用切片刀从皮质端截取组织做冷冻切片，提高了肾小球切出率。

由于肾穿刺样本送检时需用含生理盐水的纱布包裹，组织表面会吸附较多水分，传统法没有将组织表面吸附的多余水分清除，冷冻后导致组织变硬、变脆，组织容易与包埋剂分离，切片碎裂。此外，还需预切15～18 张冷冻切片备用，切片过程耗时长，且冷冻温度过低（–22～–20℃），长时间冷冻组织易变硬、变脆，也会造成切片出现碎裂状的现象[15]。本研究改进了肾穿刺样本的前处理过程，通过冷冻前采用吸水棉纸吸取肾组织表面多余水分，使包埋剂与组织充分结合，可简便有效地解决组织与包埋剂分离的现象。此外，根据肾组织的特点将箱体及样本夹温度控制在–17℃[16]，能够改善长时间冷冻后切片易碎裂的现象，较顺利的完成连续多张高质量的切片。

冷冻穿刺组织的传统法包埋没有平整的支撑平台，组织很难包在同一水平面，造成切片不完整及修切时组织损失过多[16-20]。本研究改进了肾穿刺样本的包埋方式，预先准备包埋平台，再将组织平放在已修平的包埋剂平台上，并按组织长轴与刀口平行的方向摆放，再加包埋剂包裹组织，从而能同时、完整的切到整条组织。

综上所述，对比两种肾穿刺样本冰冻制片方法，改进法的肾小球切出率为100%，显著高于传统法肾小球切出率（82.14%）；改进法切片优良率为96.43%，显著高于传统法切片优良率（71.43%）。通过改进方法，提高了肾穿刺样本冷冻切片肾小球切出率及切片优良率，对临床应用有较大的指导意义，具有一定的推广价值。

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Study of quality improvement of frozen sections of renal puncture samples

Department of Pathology, the First People’s Hospital of Huzhou, Huzhou 313000, Zhejiang, China

To improve the glomerular detection rate and the excellent rate of frozen sections of renal puncture samples.Kidney puncture tissues of 28 clinical patients in the First People’s Hospital of Huzhou from September to December 2021 were selected.By improving the methods of freezing, embedding and sectioning of renal puncture samples, the glomerular detection rate and the excellent rate of sectioning were improved.The glomerular detection rate of the improved method (100%) was significantly higher than that of the traditional method (82.14%) (2=5.490,=0.026); The excellent rate of the improved method (96.43%) was significantly higher than that of the traditional method (71.43%) (2=8.347,=0.004).By improving the method, glomerular detection rate and the excellent rate of frozen sections of renal puncture samples were increased, and has the value of clinical application.

Renal puncture samples; Frozen section; Improvement method

R365

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.26.002

浙江省教育厅科研项目（Y202043861）；湖州市科技计划项目（2020GYB13）

崔戈，电子信箱：witcui@qq.com

（2022–08–08）

（2022–12–28）