乳粉中黄曲霉毒素M1的盲样考核结果分析

张方方，邢银英，张碧宇，张亮，周建峰

（1.温州市质量技术检测科学研究院，浙江 温州，325000; 2.温州市食品药品检验科学研究院，浙江 温州，325000）

0 引 言

盲样考核是验证实验室检测能力，确保日常检测结果的准确性和可比性必须运行的一项重要质量控制活动[1-2]，是中国计量认证和中国合格评定国家认可委员会认证评审的重要内容，也是监管机构综合评价实验室检测能力的重要手段[3-6]。乳粉是最常见的乳制品之一，目前乳粉中黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1)的常用检测方法主要依据为GB 5009.24-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M 族的测定》中的第一法“同位素稀释液相色谱-串联质谱法”。

为了最大限度地控制Aflatoxin M1的摄入量，我国及世界上其他许多国家制定了乳及乳制品中Aflatoxin M1的限量标准[7-9]。GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》[10]规定，乳及乳制品中Aflatoxin M1限量为0.5 μg/kg。通过此次考核，可以进一步加强承检机构监督管理，提升食品抽检工作质量水平，促进实验室提高Aflatoxin M1的检测水平和质量，保障乳品质量安全。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器与设备

Agilent 1290/6470 LC-MS/MS 液相色谱-串联质谱（配ESI 源)，美国安捷伦公司；赛默飞世尔LP Vprtex Mixer 涡旋振荡器，美国赛默飞世尔公司；SIGMA 3K15 冷冻离心机(转速≥10 000 r/min），美国Sigma 公司；氮吹仪，上海安谱科技有限公司；Research Plus 微量移液器，德国艾本德公司；Millipore 超纯水处理系统，美国Millipore 公司；针式滤器(孔径为0.22 μm）有机相微孔滤膜，上海安谱科技有限公司。

1.1.2 试剂与耗材

黄曲霉毒素M1(AFT M1)标准溶液(10 μg/mL）、13C17-黄曲霉毒素M1(13C17-AFT M1)标准溶液(0.5 μg/mL）、甲醇(色谱纯），上海安谱科技有限公司；黄曲霉毒素M1免疫亲和柱(AflaStar IAC1005），ROMER 国际贸易有限公司；考核盲样(LH-B01)，由浙江省局食品抽检监测秘书处；实验用水由Millipore 超纯水处理系统制备。

1.2 方法

1.2.1 实验前处理

称取1 g 样品(精确到0.001 g) 于50 mL 离心管中，加入13C17- Aflatoxin M1内标溶液振荡混匀后静置30 min，加入4 mL 50 ℃热水，涡旋混匀。待样液冷却至20 ℃后，加入10 mL 甲醇，涡旋3 min。置于4 ℃、6 000 r/min 下离心10 min。将7 mL 上清液或滤液转移至烧杯中，加40 mL 水稀释，备用。将低温下保存的AflaStar IAC1005 黄曲霉毒素M1免疫亲和柱恢复至室温后，将上述混合液体倒入。用10 mL 去离子水缓冲液淋洗免疫亲和柱，去离子水淋洗完后将柱体压干。用2×1.0 mL 纯甲醇洗脱免疫亲和柱，收集洗脱液，将洗脱液于50 ℃条件下氮气吹至近干，用初始流动相定容至1.0 mL，涡旋30 s 溶解残留物，0.22 μm滤器过滤，收集滤液于进样瓶中待测。

图1 黄曲霉毒素M1 免疫亲和柱操作示意

1.2.2 色谱条件

色谱柱型号：Zorbax Eclipse Plus C18 (2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，美国安捷伦公司；液相流速：0.2 mL/min；柱温箱温度：35 ℃；进样体积为1 μL；流动相A：甲醇；流动相B：水(含0.1%甲酸和5 mmoL/L 乙酸铵)；梯度洗脱比例为：0~0.1 min，10%A~10%A；0.1~2.0 min,10%A~40%A；2.0~4.0 min，40%A~70%A；4.0~4.1 min，70%A~ 90%A；4.1~6.0 min，90%。

1.2.3 质谱条件

离子源：ESI 电离源，正离子模式，离子源温度350 ℃，质谱毛细管电压4 500 V，干燥气温度325 ℃，干燥气流速：11 L/min；雾化器压力：310.26 ka；监测模式：多反应监测(MRM)，监测参数如表1 所示。

表1 黄曲霉毒素M1 和13C17-黄曲霉毒素M1 质谱参数

1.2.4 标准溶液的配制

准确吸取10 μg/mL AFT M1标准溶液100 μL 于10 mL 容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，得到100 ng/mL的AFT M1标准工作液。取AFT M1同位素内标(0.5 μg/mL)250 μL，用乙腈稀释至25 mL，得到5.0 ng/mL 的13C17-AFTM1标准液。

标准系列工作溶液：分别准确吸取AFT M1标准工作液20、40、60、80、100 μL 至10 mL 容量瓶中，加入500 μL 5.0 ng/mL 的同位素内标工作液，用初始流动相定容至刻度，配制AFT M1的浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ng/mL 的系列标准溶液。

1.2.5 质量控制措施

根据《乳粉中黄曲霉毒素M1的测定作业指导书》的内容说明，此次提供的能力验证样品为乳粉样品，净重约10 g。为确保数据准确，根据检测标准GB 5009.24—2016，制定以下质量控制措施：测试样品的含量水平、空白样品加标回收、人员平行比对（因为此次盲样考核的时间原因，实验室未能及时配备乳粉黄曲霉毒素M1的质控样进行质量控制）。（1）测试样品的含量水平。由于作业指导书没有明确样品含量水平，所以实验先初步测试样品含量水平，再根据该水平配制合适的系列标准曲线。（2）空白样品加标。在确定样品含量水平后，在后续实验进行同等水平的样品浓度添加回收平行实验，测定并计算加标回收水平。（3）人员平行比对。实验中以2 名检测经验较为丰富的检测员同时开展盲样考核实验进行比对，以此考核人员的检测能力[11-14]。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线范围确定

根据检测标准GB 5009.24—2016，对盲样(LHB01) 进行测试，盲样中AFT M1含量在0.6 μg/kg 水平，对应的待测液浓度为0.3 ng/mL。为确保能够准确有效校正待测物，本实验配制了0.2 ~1.0 ng/mL 的系列标准溶液，线性方程为：y=1.606907x-0.038098，R2=0.9996，标准物质TIC MRM 图和系列标准曲线图，如图2 和图3 所示。

图2 黄曲霉毒素M1 MRM

图3 黄曲霉毒素M1 系列标准曲线

2.2 盲样考核结果

分别称取平行盲样(LH-B01)，按照GB 5009.24—2016 以及黄曲霉毒素M1免疫亲和柱要求开展实验，并同时进行空白实验和空白加标回收平行实验，测定结果如表2 所示。由测定数据分析得出，测定结果精密度和RSD 均小于10%，两次独立测试结果的绝对差值为1.1%，符合要求。由于I 组与II 组相比较，实验结果精密度前者为0.16%< 3.04%，且RSD 为0.9%<5.2%，平均回收率良好。依据质控数据分析，I组的数据可靠性较好，按照作业指导书保留3 位有效数字要求，本实验室选取I 组的数据“黄曲霉毒素M1含量为0.618 μg/kg”，作为此次盲样考核的最终结果上报。

表2 样品测定结果

2.3 实验室结果分析

本次盲样考核要求参加实验室为25 家，黄曲霉毒素M1考核项目的实际参加实验室为21 家，本实验室黄曲霉毒素M1的考核Z 值为“-0.9”，结果满意，其他实验室结果如表3 所示。本次盲样考核评价以组织方确认的样品指定值和能力评定标准差，对参加实验室的测试结果进行判定，判定结果分为通过和不通过 (包括不满意和可疑)。评判的参数为实验室间Z值，Z 值大小体现了实验室结果与中位值的偏离程度，Z 值“＋”、“－”表明结果偏离方向，|Z|≤2.0 为满意，2.0＜|Z|＜3.0 为可疑结果，|Z|≥3.0 为不满意(离群)结果[15]。

表3 实验室间黄曲霉毒素M1 考核评价结果

3 结 论

从实验室结果统计看出，参加黄曲霉毒素M1考核的实验室测定结果均为满意，但是分析结果均存在负偏离。此次实验的前处理包括试剂提取、过柱净化、浓缩步骤，产生测量值呈负偏离的因素可能在于13C17-AFT M1作为待测物内标为实验前临时添加，而AFT M1在乳品中可能为稳定结合存在，两者在提取率上存在一定差别，测定时应尽可能提取充分；由于黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的特殊性，尽量按照其说明进行活化、吸附和洗脱，减少待测物的流失或者洗脱不充分因素；在浓缩定容时，尽量按要求保持恒温进行氮吹，避免待测物因温度等原因影响回收结果。

实验室在此次盲样考核中取得了满意结果，实验室中的人员检测能力、设备性能和涉及的耗材试剂有效性也均得到了确认，这不仅是对实验室日常检测工作经验开展的一次总结，也是对实验室自身检测水平的提升。为今后自身的检测工作和其他盲样考核、能力验证工作提供了参照，也为其他食品实验室的同行检测人员提供盲样考核和能力验证的方案提供了借鉴。