热处理对牛乳中生物活性物质影响研究进展

宁淼，贺凯茹，杨慧，朴瑜琼，李欣霏，姜北辰，包雨飞，武俊瑞,2

（1.沈阳农业大学食品学院，沈阳 110866；2.辽宁省食品发酵技术工程研究中心，沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室，沈阳 110866）

0 引 言

热处理等手段被广泛的应用于牛乳杀菌中。该杀菌工艺对于确保牛奶微生物安全和维持牛奶质量至关重要，但杀菌过程中伴随着复杂的物理化学变化，会不可避免地对乳体系中活性成分的活性、结构产生不利影响。虽然之前已有研究证明添加保护剂可使一些特定物质保持生物活性并避免热处理时失活，但加热必然导致活性的变化，进而影响其对乳制品的功能作用[1]。因此，研究热处理对乳中生物活性物质的影响具有重要的现实意义。

1 牛乳中的生物活性物质及其功能

1.1 乳铁蛋白

乳铁蛋白（lactoferrin, LF）由铁和糖蛋白复合而成，当乳铁蛋白含铁量低于5%时，属于缺铁型乳铁蛋白（apo-LF）；当乳铁蛋白含铁量高于85%时，则属于铁饱和乳铁蛋白（holo-LF）。乳铁蛋白作为功能性成分，常被用于酸奶，婴儿配方奶粉以及膳食补充剂等多种食品中。乳铁蛋白对许多致病菌表现出抑制作用，可与免疫球蛋白协同参与局部免疫调节，提高机体免疫力。医药上也有抗菌抗炎活性，抗病毒及抗癌等功效。乳铁蛋白之所以具有广谱抗菌活性，是因为它能螯合细菌在生长过程中需要的Fe，因而能破坏细菌细胞膜并有效抑制细菌生长。Soboleva 等[2]证实LF还具有磷酸酶、过氧化物酶和蛋白酶等活性。

1.2 免疫球蛋白

人们常常把免疫球蛋白和抗体混为一谈，事实上两者并非完全等同，免疫球蛋白包括抗体，但并不都是抗体。免疫球蛋白在常乳中占1%~2%[3]。常见的免疫球蛋白包括IgA、IgG、IgM 等，其中IgG 含量最高，占80%以上[4]。有研究认为，母乳中的IgG 可与抗原形成复合物，预防哮喘等过敏性疾病，而牛乳中IgG 是否具备上述功能还有待研究[5]。

1.3 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

在牛乳乳清蛋白中，α-乳白蛋白（α-lactalbumin,α-La）的含量占27%左右，是唯一能与Ca2+结合的营养成分[6]，其与Ca2+的结合，不仅能促进钙的吸收，还增强了自身的稳定性。α-乳白蛋白在氨基酸比例、结构及功能特性方面与人乳非常相似，将其添加到母乳中有助于婴儿的生长发育[7]。

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-Lg）含量约占乳清蛋白的50%，是氨基酸的重要来源，有利于蛋白质的合成。迄今为止，对β-乳球蛋白的研究主要集中在营养功能、分子结构、热特性以及在保健食品开发中的应用等方面。随着研究的不断深入，β-乳球蛋白的价值将会被人们更好的挖掘利用。牛乳中生物活性蛋白的主要功能如表1 所示。

表1 生物活性蛋白的主要功能

1.4 乳过氧化物酶

乳过氧化酶（lactoperoxidase, LPO）可与过氧化氢、硫氰酸根形成乳过氧化物酶体系，参与宿主防御系统的构成，以抵抗微生物的侵害，延长乳制品的货架期。LPO 具有广谱抗菌性，可阻止过氧化物的累积，减少致癌物的产生，对免疫系统有一定的保护作用[9-10]。

1.5 不饱和脂肪酸

牛乳中含有少量不饱和脂肪酸，是机体不可缺少的营养成分，其含量与奶牛泌乳期和胎次有关[11]。包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、α-亚麻酸（αlinolenic acid, ALA）和共轭亚油酸（conjugated linoleic acid, CLA）等。影响牛乳中不饱和脂肪酸的因素及其功能如表2 所示。

表2 影响牛乳中不饱和脂肪酸的因素及其功能

1.6 生长因子

牛乳中的生长因子大多为多肽类物质，具有耐热性。有些重要生长因子的化学成分与人乳中的相似。牛乳中的生长因子主要包括表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）、胰岛素样生长因子（insulin like growth factor, IGF）、转化生长因子-β（transforming growth factor beta, TGF-β）和β细胞素（betacellulin,BTC）等，作用如表3 所示，其中表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1（IGF-1) 以及转化生成因子-β1（TGF-β1）含量较高。在奶牛产犊后的一个小时内，生长因子在牛初乳中的含量达到最高，之后会随着产犊时间的增加而降低。

表3 牛乳中主要生长因子的作用

2 热处理对牛乳中乳铁蛋白的影响

乳铁蛋白含量和活性的变化是加工过程中的一个主要问题[16]。通过对牛乳LF 在72～85 ℃变性一级反应动力学进行研究，发现apo-LF 较holo-LF 易变性，这可能是由于铁离子的结合使LF 二硫化物发生结合从而阻止蛋白聚合所致，同时利用热诱导的动力学参数证实，LF 在变性过程中受铁结合状态的影响，使apo-LF 与holo-LF 构象发生独立扩展，apo-LF 在60 ℃左右时发生变性，其暴露的非共价键位点与二硫键形成非共价键聚合体。而含铁量高的holo-LF 结构较稳定，在80 ℃条件下可与二硫键反应，生成可溶性聚合体，说明蛋白质一定程度上的变性会影响其构象稳定性，结果损失部分活性，或造成聚集，沉淀而失去作用[1]。

Franco 等[17]研究证明，巴氏杀菌不影响乳铁蛋白与细菌之间的相互作用能力，并且对乳铁蛋白的结构没有产生影响；而超高温瞬时杀菌（Ultra-high temperature instantaneous sterilization, UHT）处理可不同程度地降低乳铁蛋白与细菌的相互作用能力。刘海燕[18]通过实验得出，在90 ℃/15 s 热处理条件下，乳铁蛋白的检出量极低；当热处理温度高于95 ℃时，乳铁蛋白的降解率达到了100%。Liu 等[19]发现在巴式杀菌条件下，中国牛奶LF 的活性保留率低于新西兰牛奶，可能是由于LF 铁饱和度不足而造成的。

3 热处理对牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的影响

3.1 热处理导致的含量和活性的变化

β-乳球蛋白作为牛乳中对热不稳定的一类营养物质，加热过程中会发生一系列变化。Lan 等[20]认为，温度决定着β-乳球蛋白的变性，牛乳经105 ℃/15 s热处理后检测到其含量仅为0.07 mg/mL，温度升至115 ℃时，β-乳球蛋白已经完全变性。

β-乳球蛋白包括2 种变异体A 和B(β-LgA、β-LgB)。其中β-lgB 对热最敏感，β-lgA 次之，α-乳白蛋白耐热性最强。孙琦等[21]研究表明，随着热处理温度的提高，ɑ-乳白蛋白、β-lgA 和β-lgB 含量逐渐降低，β-lgA 和β-lgB 分别在125 ℃、95 ℃时已无法检出，而ɑ-乳白蛋白在UHT 灭菌温度下依然存在。这也证实了Lan 等人的研究结果。此外，对比巴氏杀菌和UHT 杀菌处理方式发现，低温长时间巴氏杀菌对β-Lg 和α-La 的热损伤小于高温短时间巴氏杀菌，且经巴氏杀菌后低温存放的鲜牛奶能最大程度的保留α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，UHT 乳中α-La 和β-Lg 含量最低[22-24]。通过对比不同种类的乳发现牛乳中α-乳白蛋白的耐热性不如骆驼奶，变性温度也较低。在90 ℃，5 min 的处理条件下，骆驼奶中有33%的α-乳白蛋白变性，而牛乳中却有95%的α-乳白蛋白变性[25]。

3.2 热处理导致的聚合物的形成

对牛乳进行热处理可导致乳清蛋白之间及乳清蛋白与酪蛋白之间发生聚合反应。当温度为75 ℃时，巯基团因β-乳球蛋白的去折叠化而裸露，与具有二硫键的游离κ-酪蛋白发生巯基-二硫化物交换反应，形成β-乳球蛋白与κ-酪蛋白复合物。而且，活化的β-乳球蛋白可产生硫化氢，使牛乳具有“烹调味”而影响口感[22]。

α-La 热变性的本质是蛋白结构的去折叠化，暴露出分子内部的二硫键。虽然α-乳白蛋白不含游离—SH，但其中的S—S 被破坏后会与含有游离—SH的β-乳球蛋白聚合形成复合物，具有与κ-酪蛋白反应的趋向，由于β-Lg 具有游离巯基，在很大程度上决定了乳清蛋白在牛乳中的热变性和聚集，因此这种聚合以β-Lg 为主，α-La 为辅。α-La/β-Lg 聚集体形成后，具有活性—SH 的β-Lg 与κ-CN 结合，同时实现了α-La 与酪蛋白的反应。可见α-La、β-Lg 与酪蛋白胶束之间的聚集体形式，一种是β-Lg 聚集体与κ-CN 结合，另一种是α-La/β-Lg 聚合物与κ-CN结合[26]。

4 热处理对乳中免疫球蛋白的影响

国内外研究学者对免疫球蛋白的热稳定性展开了相关研究。发现免疫球蛋白的热变性是一个展开又聚合的过程，对其肽链的展开及构象变化有不同程度的影响。在低温下，三级结构可能发生展开，但一些展开的区域可能是可逆的。此外，研究发现在75~77 ℃条件下，温度每升高1 ℃，免疫球蛋白损失15%~30%[27]。在探究牛初乳中IgG 在不同热处理条件下的变化规律时，发现牛初乳经过55 ℃、30 min 的热处理后，IgG 含量明显下降，之后经一系列热处理条件后，均低于牛初乳中的IgG 水平[28]。这可能是由于热处理后IgG 分子变形或展开所致。与Fc 段相比，IgG 中Fab 段的CH区不稳定，容易展开，导致Fab 段结构改变，IgG 活性丧失。

杨红等[29]曾在研究中阐述，IgG 的耐热程度与IgG的纯度密切相关，纯度越低，耐热性越好。而IgG 变性程度与加热温度和时间成正比，即热处理温度越高、时间越长，其变性程度越高。UHT 和加热蒸发几乎能完全破坏IgG 的活性，而HTST 杀菌和间歇式巴氏消毒处理后的IgG 活性仅损失0.5%~10%。任璐[30]在传统高温热杀菌、蒸汽浸入式杀菌、膜过滤结合巴氏杀菌对ESL 牛乳品质的影响的实验中表明，膜过滤结合72 ℃、15 s 的杀菌能更好地保留IgG。

5 热处理对牛乳中乳过氧化物酶的影响

乳过氧化物酶的热稳定性高于其他乳中的内源酶。Lorenzen 等[31]对乳过氧化物酶活性在不同温度下的变化进行了研究，发现牛乳中的LPO 活性随着温度的升高而不断下降，经过65 ℃、90 s 加热后其活性约为原料乳的65%，原料乳经过75、85 ℃加热90 s后，LPO 活性已不足原料乳的0.17%。

此外，也有一些研究通过测定牛乳中LPO 不同温度下的D 值和Z 值来反映其活性，且结果存在一定差异。Tayefi-Nasrabadi 等[32]研究了热处理对牛乳中LPO 的影响，用D 值和Z 值表示。研究发现，牛乳中LPO 活性在67、69、71 ℃和73 ℃的D 值依次降低，Z 值为4.7 ℃。Loredana 等[33]分析了牛乳中LPO在70~77 ℃条件下的活性变化。发现LPO 活性的D值随着温度的升高而逐渐降低，Z 值约为3.58 ℃。LPO 钝化温度的差异与牛乳样品中的脂肪含量有关，也可能与酸度有关，因为LPO 在酸性条件下热稳定性差，关于这一假设仍需要进一步验证。

Wendie 等[34]报道经过72 ℃、15 s 的巴氏杀菌，LPO的活性为加热前的70%，经过UHT 处理后LPO 没有活性。纯化分离的LPO 经70 ℃、15 min 杀菌后，LPO依然是稳定的，但在78 ℃、15 s 时完全失活。对乳过氧化物酶不同工艺下的活性进行研究，发现其在75 ℃、15 s 的条件下可检测到较高的乳过氧化物酶活性[35]，而经85 ℃或125 ℃处理15 s 后基本检测不出活性。

6 热处理对牛乳中生长因子的影响

生长因子的热变性变化与其分子结构有关，分子具有很强的疏水性，这有利于自身聚合和与其他蛋白质的非特异性相互作用。巴氏杀菌处理下，乳中的生长因子浓度较高，较高温度下，生长因子多数与牛乳中高分子质量的蛋白质结合，并且以潜在的形式存在。

热处理可以激活生长因子，Pia 等[36]发现，牛乳经过65 ℃和72 ℃加热15 s 后，IGF-I 的浓度较原料乳高，当原料乳经过90 ℃、15 s 的热处理后，IGF-I 的浓度急剧增加，而经过135 ℃、15 s 加热后，IGF-I 活性降低，进而指出90 ℃加热可以激活IGF-I。Kang 等[37]研究发现，在原料乳中添加冻干的初乳乳清粉能够增加IGF-I 的水平，经过75 ℃和85 ℃加热15 min 后，其浓度降低，分别为加热前的45.05%和45.25%；经过121 ℃、15 min 的热处理后牛乳中没有检测出IGF-I活性。Yun 等[38]研究表明，IGF-I 在UHT 乳中比一些生物活性蛋白的热稳定性还要强。

7 热处理对牛乳中不饱和脂肪酸的影响

热处理决定乳中不饱和脂肪酸的浓度和氧化程度。研究发现HTST 和UHT 处理对牛乳中CLA 和ALA 的浓度没有影响[39]。然而，Xu 等[40]人发现，与生牛乳相比，UHT 牛奶中的不饱和脂肪酸浓度降低了53%。Dias 等[41]研究中表明，HTST 和UHT 处理后的牛乳中亚油酸和a-亚麻酸的氧化产物浓度比它们在生牛乳中的氧化产物浓度低51%~64%，这是因为它们又生成了二级氧化产物。

8 展 望

目前，国内外研究者已对牛乳中生物活性物质的种类和功能进行了较为全面的研究。而本文对牛乳中生物活性化物质在热处理后的变化进行了较为详细的论述，为牛奶生物活性物质的应用提供了参考。但加热过程中生物活性物质活性变化的分析与研究仍主要集中于活性的比较方面，同时对这些活性物质在热处理后的生物可及性和生物利用度还没有充分的了解和研究，在此基础上还需要更多的体外和体内研究来了解牛乳的热处理对人体健康的影响。此外，还可以对牛乳的热处理方法进行创新，以生产具有丰富营养价值和生物活性成分的乳制品。