蒙古族木桶发酵奶酪成熟阶段风味变化研究

林佳卫，焦昱玮，刘敏，杜浩月

（1.内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古 包头 014109；2.宁夏大学，银川 750000）

0 引 言

蒙古族牧民采用木桶发酵制作奶酪制品，木桶由于历经多年使用，具有非常独特的菌群结构，通过木桶发酵的奶酪产品深受牧民的喜爱。奶酪品质好坏主要受风味物质的影响[1]，因而对木桶发酵奶酪中风味物质的研究具有重要意义。目前，国内外对于西方奶酪的研究主要针对其诸多影响因素以及成熟过程中的挥发性风味物质[2]，国内的研究多数是以奶酪加工工艺和发酵剂对奶酪风味的影响为主[3-7]，对不同成熟时期奶酪中挥发性风味成分的差异较少报道。

奶酪中的香气成分多种多样，结构极其复杂，萃取技术是奶酪风味分析的前期关键技术。通常将SPME 萃取装置与GC-MS 等仪器结合使用进行风味检测与分析[8]，其已广泛应用于食品中挥发性风味物质的检测中。食品风味物质分析和测定中广泛采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），在挥发性和半挥发性样品中检测挥发性风味物质应用较多。目前顶空固相微萃取/气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME/GC-MS）主要应用于普洱茶、奶酪、啤酒、黄酒、白酒风味物质的分析检测中[9-11]。

本研究以不同成熟阶段蒙古族木桶发酵奶酪作为研究对象，釆用顶空固相微萃取（solid phase microextraction, SPME）和气相色谱-质谱联用技术（gas chromatograph-mass spectrometer, GC-MS），将不同成熟时间段奶酪中的挥发性风味组分物质进行检测，并采用主成分分析（principal component analysis，PCA）方法对风味组分进行分析，从而进一步阐明蒙古族木桶发酵奶酪在不同成熟时间风味物质的变化情况，从而为制备适合我国消费者喜爱的传统酸凝奶酪提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及设备

采自内蒙古锡林郭勒盟西乌珠穆沁旗牧民木桶制作奶酪(成熟0、10、20 和30 d)。

安捷伦6890N-5973 气相色谱-质谱仪，美国Agilent 公司；75 μm CAR/PDMS 的固相微萃取头，美国Supelco 公司；B15-3 智能恒温数显定时磁力搅拌器（10 L，1 500 r/min，上海司乐仪器有限公司；LG10-2.4A 管式离心机，北京京立离心机有限公司。

1.2 方法

1.2.1 干酪游离氨基酸含量测定

参照 食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定GB 5009.124-2016[12]。

1.2.2 干酪基本成分的测定

水分含量的测定：参照GB5009.3—2016[13]。脂肪含量的测定：参照GB5009.6—2016[14]。干酪的蛋白质含量测定：采用凯氏定氮法，参照GB5009.5—2016[15]。

测量pH 值，取每个奶酪样品5 g 进行研磨，与10 mL 无二氧化碳的蒸馏水混合，然后使用校准的pHS-3C 型精密pH 计进行测定。

1.2.3 风味物质的测定

1.2.3.1 固相微萃取[16]

将保存好的干酪，分别抽取成熟0、10、20 和30 d样品2.0 g 放入15 mL 萃取瓶中，放置于60 ℃恒温水浴锅中保持30 min，将老化好的萃取针头插入到萃取瓶中进行萃取，萃取完成后，取出纤维头插入到气相色谱（汽化室）中进行GC-MS 分析，每个样品重复进行3 次分析。

1.2.3.2 GC 条件

色谱柱升温程序为：起始柱温为40 ℃，保持4 min后，以4 ℃/min 速度升到100 ℃，保持2 min，然后升到150 ℃，以6 ℃/min 的速度，最后以5 ℃/min 速度升到230 ℃，保持5 min。进样口温度设置为250 ℃，无分流进样处理。采用30 m×0.25 mm×0.25 μm Agilent DB-WAX 聚乙二醇（PEG）气相毛细管柱，流速为1 mL/min，载气为氦。

1.2.3.3 质谱条件

电离能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，接口温度250 ℃，四级杆温度150 ℃，检测器温度为280 ℃，扫描模式为全扫描，质量检测范围为20～350 amu。

1.2.4 统计分析

采用软件方差分析（ANOVA）进行理化性质(水分、蛋白质、脂肪和pH）和风味有关的数据进行显著性分析，当P<0.05 认为存在统计学差异；并采用Origin (OriginLab 公司出品)软件对挥发性化合物进行主成分分析(PCA)、相关性和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 木桶发酵奶酪成熟期间游离氨基酸含量分析

木桶发酵奶酪在不同成熟时间（0、10、20、30 d)测定的氨基酸含量动态变化如图1 所示。

图1 不同成熟阶段干酪游离氨基酸含量

木桶发酵奶酪中共检测到18 种游离氨基酸。当奶酪成熟到第10 d，多数游离氨基酸含量下降，这一因素的发生，可能与大量酯类物质的产生有关。随着干酪成熟时间的逐渐延长，游离氨基酸含量显著增加（P<0.05），20 d 时氨基酸含量达到最大，30 d 时大多数开始下降。20 d 时开始增加的游离氨基酸是天冬氨酸（Asp）、丝氨酸(Ser）、异亮氨酸（Ile）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）、缬氨酸(Val）、亮氨酸（Leu)、赖氨酸（Lys）和脯氨酸（Pro），其中Asp、Leu、Glu和Pro 呈显著增加（P<0.05）；亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）和赖氨酸(Lys）这4 类氨基酸常被用作衡量西方（切达）干酪成熟度的标志[17]。支链氨基酸亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）、芳香族氨基酸苯丙氨酸（Phe），酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）是风味化合物的前体物质，对干酪风味的形成起主要作用[18]。生成含量最多的支链氨基酸Leu 经过转氨酶生物合成及Strecker 降解，经转氨、脱羧、还原形成3-甲基-1-丁醇，赋予木桶奶酪特殊的风味，但随着成熟时间的延长，其含量在逐渐消失，降低的原因推测是合成相应的酯类如乙酸苯乙酯和辛酸异丁酯等物质导致。苯乙醇是由苯丙氨酸经酵母菌作用Strecker 降解代谢形成[19]，赋予奶酪玫瑰和发酵香气，有涩感和苦味。脯氨酸，丝氨酸和天冬酰胺随着成熟时间延长大量生成，可能与木桶奶酪甜味生成有关。

2.2 木桶发酵奶酪基本成分分析

蒙古族木桶奶酪在不同成熟期(0、10、20、30 d) 的相关理化指标（水分、蛋白质、脂肪和pH 值）测定结果如表1 所示。

表1 木桶奶酪成熟期间理化指标的变化

由表1 可知，不同成熟期间水分、脂肪含量、pH值和蛋白质含量均有统计学差异（P<0.05）。随着成熟时间延长，水分含量逐渐减少；脂肪水解量前期降低，30 d 时开始上升；蛋白质含量呈上升趋势；成熟前期由于乳酸菌活力较高，大量乳糖分解，从而导致乳酸呈上升趋势，所以在成熟0～20 d 时pH 值较低，随着成熟时间延长到30 d 时，乳糖水解能力逐渐减弱，蛋白质水解加剧，此时，pH 值逐渐上升；总体来看，由于成熟期间水分大幅降低，导致脂肪与蛋白质含量趋于增大状态。

2.3 木桶发酵奶酪成熟期间挥发性成分变化的比较分析

成熟期(0、10、20、30 d)的蒙古族木桶发酵奶酪的挥发性风味物质分析结果如表2 所示。共检测出56种风味物质，主要包括酸类、醇类、酯类、酮类、醛类和其他类( 烯类、酚类和呋喃化合物) ，共计8 大类风味物质。成熟期在20 d 时，蛋白质的水解引起挥发性风味化合物种类增加，这种变化趋势与游离氨基酸变化情况相一致。

表2 不同成熟期木桶奶酪挥发性风味化合物分析

酸类化合物是奶酪成熟过程中脂类降解、蛋白质水解和乳糖发酵生成[20]。在不同成熟阶段，对木桶发酵奶酪风味产生重大影响的物质是乙酸、丁酸、月桂酸、甲基丙二酸、辛酸、顺-5-十二碳烯酸这6 种酸类化合物。其中丁酸和辛酸的风味阈值较低，在高浓度下产生令人不悦的风味给奶酪风味品质带来不利影响[21]。醇类物质是干酪中重要风味化合物，从表2 中可知，随着成熟时间的延长，成熟10 d 时，醇类化合物种类减少，可能是醇类物质与酸发生反应生成酯类，大量生成的酯类物质可削弱由于脂肪酸产生的刺激味和氨基产生的苦味[22]。其中黄油酯包含丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯，常温易挥发，凭借此特点这类物质可对风味产生较大贡献[23]，是乳制品中特征风味组分物质，赋予奶酪香气轮廓中的花果味，在不同成熟期木桶发酵奶酪中己酸乙酯的含量差异显著（P<0.05），随着成熟时间的延长，己酸乙酯的含量增加。2-庚酮和2-壬酮含量差异显著（P<0.05），2-壬酮使奶酪具有花香味、水果味和桃子味[24]；2-庚酮使奶酪呈现甜味，壬醛呈玫瑰香味，阈值较低，对木桶发酵奶酪的风味有很好的修饰作用。成熟20 d 时，2-庚酮和2-壬酮的含量呈现增加趋势，对风味的形成起到关徤作用。香茅烯在0 d 时检测到，其主要是牛食用香草产生，随着成熟时间的延长，在奶酪中没有检测到。酚类和呋喃类物质使奶酪具有特殊的奶油香味，在成熟过程中均有检测到。

采用主成分分析 ( principal component analysis，PCA)方法，对木桶发酵奶酪中风味物质相对含量进行分析，进而确定其在不同成熟阶段的主要风味物质，结果如图2、图3、图4 所示。由图2 可知，PC1 的贡献率为34.9%，PC2 的贡献率为26.9%。4 个时间段样品中0 d 和10 d 的距离相对较远，比较分散表明样品之间的挥发性成分存在一定的差异，20 d 和30 d 的距离相对较近，说明这个阶段的挥发性风味基本相似。

图2 样品按照主成分1、主成分2 分类

图3 木桶奶酪发酵挥发性风味成分的负载

图4 挥发性化合物与理化指标的相关分析系数

对不同成熟阶段的挥发性风味化合物和理化指标进行了区分如图3 所示。风味物质随着时间的延长而增加。蛋白质、脂肪和pH 值成分在PCA 图中横坐标PC1 上具有较高的载荷，说明在成熟20～30 d 时，蛋白质、脂肪和pH 值变化存在显著差异。水分位于主成分PC2 的负侧，说明在0 d 时其差异显著。作为主要风味物质的苯乙醇、乙酸苯乙酯、乙酸苯乙酯、肉豆蔻酸乙酯和乙酸异戊酯在20～30 d 差异显著。10 d 时差异显著的物质是酯类化合物辛酸丙酯、十一酸乙酯、十三酸乙酯、棕榈酸乙酯和辛酸异丁酯。0 d 时差异显著的物质是乙酸、甲基丙二酸、3-甲基-1-丁醇、2-壬醇和香茅烯。

图4 显示了理化指标水分（Moisture)、蛋白质(Protein)、脂肪(Fat)和pH 值和风味物质的相关性。结果表明，水分（Moisture)含量与风味物质9-癸烯酸、月桂酸、3-甲基-1-丁醇、正己酸乙酯、反油酸乙酯、甲基壬基甲酮、4-甲基苯酚呈显著正相关（P<0.05）。蛋白质(Protein)、脂肪(Fat)和风味物质（正己酸、辛酸、肉豆蔻油酸、丁酸、正癸酸、乳酸、异戊酸和壬酸乙酯）呈显著正相关（P<0.05）。pH 值与正己酸呈正相关（P<0.05）。

图5 结果直观地呈现了不同成熟时间段木桶发酵奶酪中56 种风味化合物变化如图3 所示，从图5可知，在0 d 时，生成较多的酸类、醇类和少量酯类、酮类及其它物质（乙酸、甲基丙二酸、甲基丙二酸、正辛酸、3-甲基-1-丁醇、2-庚醇苯乙醇、2-壬醇、乙酸壬酯、乙酸苯乙酯、十四酸乙酯、乙酸乙酯、甲基壬基甲酮、2-十三烷酮、香茅烯和4-甲基苯酚），风味物质呈现多样化。当成熟到第10 d 时，大量的脂类（辛酸乙酯、辛酸丙酯、壬酸乙酯、十一酸乙酯、月桂酸乙酯、十五酸乙酯、反油酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、十三酸乙酯和棕榈酸乙酯）物质生成，大多数酯类物质带有特有的花香味、浓烈的水果味以及酵母发酵香味(酒香)，其中乙酯类物质被公认为干酪中水果味重要的来源[25]，对干酪风味起到了重要作用。20 d 时主要生成酸类、醇类、酯类和酮类物质（辛酸、肉豆蔻、油酸丁酸、氧化肉桂酸、异戊酸(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇、1-壬醇、异戊醇、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、2-庚酮、2-壬酮、2-戊酮、仲辛酮），此时，会有少量香味物质产生[26]。30 d 与20 d 成熟奶酪挥发性成分分布没有显著差异，这与两者具有较接近的酸与酮类物质有关。并且随着水分的大量减少，风味物质含量不断下降。由此可知：成熟时间在0 d 时食用风味较好，20 d 时风味物质种类较多，此时奶酪风味最佳，达到最佳食用状态。

图5 木桶奶酪各品质指标聚类热图

3 结 论

木桶发酵奶酪在成熟过程中，20 d 时游离氨基酸Asp、leu、Glu 和Pro 呈显著增加（P<0.05），随着成熟时间的延长含量开始逐渐下降。水分和脂肪随着成熟度的升高逐渐出现下降趋势，蛋白质和pH 随着成熟度的升高逐渐出现上升趋势。通过PCA 分析可知：在成熟20～30 d 时，蛋白质、脂肪和pH 值变化存在显著差异。水分在0 d 时差异显著。

通过理化指标与风味相关性分析可知：水分（Moisture)含量与风味物质（9-癸烯酸、月桂酸、3-甲基-1-丁醇、正己酸乙酯、反油酸乙酯、甲基壬基甲酮、4-甲基苯酚） 呈显著正相关（P<0.05）。蛋白质（Protein）、脂肪（Fat）和风味物质（正己酸、辛酸、肉豆蔻油酸、丁酸、正癸酸、乳酸、异戊酸和壬酸乙酯）呈显著正相关（P<0.05）。pH 值与正己酸呈正相关（P<0.05）。

在不同成熟时间木桶发酵奶酪共检测出56 种风味物质。在0 d 时，生成较多的酸类、醇类和少量酯类、酮类及其它物质，此时风味较好。当成熟到第10 d 时，大量的脂类物质生成。20 d 时，奶酪风味最佳，这与该时间段产生的酸类、醇类、酯类和酮类物质息息相关。成熟20 d 和30 d 时挥发性成分分布没有显著差异，并且随着水分的大量减少，风味物质含量不断下降。