青稞酒糟多酚提取工艺优化及其抗氧化性

杨婷婷，罗毅皓*，张艺炜，冯声宝，孙万成，谈婷，李善文，孔令武

（1.青海大学农牧学院，青海西宁 810016；2.青海互助天佑德青稞酒股份有限公司，青海海东 810500）

青稞是种植在高原缺氧环境中的一种特色农作物，与酿酒常用的高粱相比，青稞的营养成分具有一定优越性，含有更丰富的β-葡聚糖、多酚和维生素B

等营养物质[1]。目前有研究发现青稞总多酚含量可达到414.55 mg/100 g，比燕麦和藜麦中的总多酚含量更高[2]，且不同品种和产地的青稞中总多酚含量存在显著差异[3]。青稞多酚提取物中主要以结合酚为主[4]，其次为游离酚。经过发酵处理后的青稞多酚抗氧化能力提高，即在微生物作用下多酚以游离态溶出，使游离多酚和结合多酚的含量均显著增加，且总多酚与抗氧化活性之间存在极强的相关性，因此总多酚含量增加能提升青稞多酚的抗氧化活性[5]。

青稞酒是以青稞为主要原料，采用“清蒸清烧四次清”的独特酿造工艺制成的清香型白酒。与传统高粱酒相比，青稞酒酸和酯的比例较低，微量风味成分的含量更丰富，含有18 种对人体健康有益的差异萜烯类物质[6]。

青稞酒糟（highland barley fermentation spent，HBFS）是青稞酒酿造后剩余的酒渣，别名酒醅糟和粕，是一种纯青稞原粮酒糟[7]。湿青稞酒糟产量大，目前青稞酒的年销量1.13 万t[8]，酿造1 t 青稞酒会产生1 t 左右的HBFS。前期研究发现酿造后的酒糟中含有多酚、维生素、蛋白质、γ-氨基丁酸以及β-葡聚糖等物质[9]，Gibreel等[10]研究发现，酒糟中含有丰富的酚类化合物。与传统高粱酒糟相比，青稞酒糟中单宁含量更低，蛋白质和碳水化合物含量更高[11]，同时青稞酒糟pH 值约为3.5，营养丰富的酸性环境利于微生物生长，导致酒糟腐败，从而造成环境污染和资源浪费。因此，以酒糟为原料提取活性成分能有效防止环境污染，且具有低成本、高效益等优点。

目前国内外学者的研究成果表明，HBFS 最主要的利用途径是制成饲料和肥料[12]，但这种简单的处理方式会造成资源浪费及产品附加值低。有学者研究发现微波提取的啤酒麦糟（brewers'spent grain，BSG）的酚类化合物具有良好的抗氧化能力[13]；Landeka Jurˇcevic等[14]研究发现葡萄酒糟多酚对抗氧化应激有显著作用。因此，研究青稞酒糟酚类化合物的抗氧化活性，是实现青稞酒糟高值化利用的有效途径之一。

目前超声波辅助提取已应用于多种植物化合物的提取[15]，通过提高萃取温度，提高待萃取植物化合物的溶解度，显著缩短提取时间，但易氧化的酚类化合物长时间暴露于高温环境中会加速氧化。因此，获得最佳的提取温度、提取时间和料液比对于最大限度地提高工艺得率和目标化合物的稳定性非常重要。本研究采用超声波辅助提取青稞酒糟多酚并对其进行体外抗氧化活性研究，以期为后续开发新型抗氧化产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青稞酒糟：青海互助天佑德青稞酒股份有限公司；1.1-二苯基-2-苦肼基（1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（≥97.0%）（生化试剂）：合肥博美生物科技有限责任公司；福林酚试剂（生化试剂）：北京索莱宝科技有限公司；抗坏血酸（VC）（分析纯）：天津市福晨化学试剂有限公司；没食子酸标准品（纯度≥98.0%）：北京奥科生物技术有限责任公司。

潮汐研磨机（800A）：东莞市华太电器有限公司：电子分析天平（ESJ110-413）：沈阳龙腾电子有限公司；双光束紫外可见分光光度计（UV-1780）：岛津仪器（苏州）有限公司；数显恒温水浴锅（HH-6）：常州市金坛友联仪器研究所；循环水式多用真空泵（SHB-III）：郑州长城科工贸有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

取一定量干酒糟，潮汐研磨机打粉。过80 目筛，备用。

1.2.2 单因素试验

根据朱俊玲等[16]的方法稍作修改，得到多酚提取液，于4 ℃冰箱中保存，待测。

固定超声温度60 ℃，料液比1 ∶15（g/mL），超声时间40 min，考察超声功率（240、320、400、480、560 W）对多酚得率的影响。

固定超声温度60 ℃，料液比1 ∶15（g/mL），超声功率400 W，考察超声时间（30、35、40、45、50 min）对多酚得率的影响。

固定料液比1 ∶15（g/mL），超声功率400 W，超声时间40 min，考察超声温度（40、45、50、55、60 ℃）对多酚得率的影响。

固定超声温度60 ℃，超声功率400 W，超声时间40 min，考察料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]对多酚得率的影响。

1.2.3 正交试验

根据单因素试验结果，选择超声温度、超声功率、超声时间和料液比进行四因素四水平的正交试验对提取工艺进行优化。正交试验因素与水平如表1所示。

1.2.4 多酚得率测定的计算

参考T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中总多酚含量的测定分光光度法》[17]稍作修改进行检测。

标准曲线的制作：称取一定量的没食子酸标准品，用水配制成浓度为0、4、8、12、20、30 mg/L 的溶液。取1.0 mL 没食子酸溶液、2.5 mL 福林酚试剂和2.5 mL 15% Na2CO3溶液加入10 mL 具塞试管中，蒸馏水定容至刻度，振荡1 min，于40 ℃水浴中反应60 min，在750 nm 波长下测定吸光度。

待测液的配制：将1.0 mL 青稞酒糟多酚提取液加入10 mL 容量瓶中，用9 mL 60%乙醇定容至刻度，超声处理10 min 后，静置待测。

将1.0 mL 待测液、2.5 mL 福林酚试剂和2.5 mL 15% Na2CO3溶液加入10 mL 具塞试管中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀。40 ℃水浴60 min，静置冷却20 min，待测。

多酚含量计算公式如下。

X=c×10×n

式中：X表示提取液中的多酚含量，mg/mL；c表示由标准曲线计算得出的待测液中的多酚含量，mg/mL；10 表示稀释倍数；n表示样品稀释倍数。

多酚得率计算公式如下。

式中：A表示多酚得率，mg/g；X表示提取液中多酚的含量，mg/mL；v表示提取液总体积，mL；m表示HBFS的质量，g。

1.3 青稞酒糟多酚的体外抗氧化试验

1.3.1 对DPPH·的清除效果

参考Abeynayake 等[18]的方法稍作修改。向具塞试管内加入0.5 mL 样品液和2 mL 0.04 mg/mL DPPH 溶液（吸光度记为A）i，取无水乙醇代替DPPH 溶液（吸光度记为A）j，取无水乙醇代替其中的样品溶液（吸光度记为A）0，上述3 种混合液混匀后于室温下放置30 min，2 000 r/min 离心10 min，取上清液在517 nm 处测定吸光度。VC做阳性对照。DPPH·清除率（Y1，%）计算公式如下。

Y1=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1.3.2 对羟基自由基（·OH）的清除效果

参考谷睿等[19]的方法进行检测。取1 mL 8.8 mmol/L过氧化氢溶液、1 mL 9 mmol/L 硫酸铁溶液、1 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，不同浓度的样品溶液1 mL 和去离子水（吸光度记为A）x；用去离子水替代其中的过氧化氢溶液（吸光度记为A）y，用过氧化氢代替其中的样品溶液（吸光度记为A0），摇匀后于37 ℃水浴15 min，在510 nm 处测定吸光度。以VC作为阳性对照。·OH 清除率（Y2，%）计算公式如下。

Y2=[1-（Ax-Ay）/A0]×100

1.3.3 对超氧自由基（·O2-）的清除效果

参考Kiss 等[20]的方法稍作修改。4 425 μL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，加入邻苯三酚溶液75 μL，迅速混合，每30 s 记录1 次读数，30 s 时的吸光度记为A30；300 s时的吸光度记为A300，即ΔA0=A300-A30。

取450 μL 样品溶液，2 500 μL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.4），再加邻苯三酚溶液50 μL，迅速混合，每30 s 记录1 次读数，30 s 时的吸光度记为A30；300 s时的吸光度记为A300，即ΔA样=A300-A30。空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。·O2-清除率（Y3，%）计算公式如下。

Y3=（ΔA0-ΔA样）/ΔA0×100

1.4 数据统计与分析

采用IBM SPSS statistics 24 软件对数据进行显著性分析，以P<0.05 表示差异显著，绘图选用Origin Pro软件，所有试验至少重复3 次，数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 青稞酒糟多酚的提取工艺优化

2.1.1 青稞酒糟多酚含量的测定结果

标准曲线见图1。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve

采用不同浓度没食子酸制作标曲，得到线性方程y=0.010 33x+0.008 4，R2=0.998 1，线性关系良好。对照标准曲线方程，计算待测液中青稞酒糟的多酚含量。

2.1.2 单因素试验

2.1.2.1 超声功率对多酚得率的影响

超声功率对多酚得率的影响见图2。

由图2 可知，超声功率在240～400 W 时，青稞酒糟多酚得率随着超声功率增加而增加，超声功率在400～560 W 时，青稞酒糟多酚得率随着超声功率增加而减少，在400 W 时达到最大值。随着超声功率的增加，超声波的空化效应使青稞酒糟中植物细胞壁被大量破坏，加速多酚进入提取溶剂中，但当超声功率过高时，较高的超声功率产生热效应使提取溶剂中部分多酚溶解，导致多酚得率降低。因此选择320、400、480、560 W 进行正交试验。

2.1.2.2 超声时间对多酚得率的影响

超声时间对多酚得率的影响见图3。

图3 超声时间对多酚得率的影响Fig.3 Effect of ultrasound time on yield of polyphenols

由图3 可知，随着提取时间延长，青稞酒糟的多酚得率先增大后减小，在超声40 min 时达到峰值。出现这种现象的原因可能是超声时间越长越利于多酚溶出，但多酚长时间处于高温环境和超声环境中，超声波的热效应对青稞酒糟多酚的稳定性产生不利影响，溶液中部分多酚类物质降解，导致多酚得率降低。因此选择35、40、45、50 min 进行正交试验。

2.1.2.3 超声温度对多酚得率的影响

超声温度对多酚得率的影响见图4。

图4 超声温度对多酚得率的影响Fig.4 Effect of ultrasound temperature on yield of polyphenols

由图4 可知，超声温度低于55 ℃时，多酚得率随着温度升高而增加，可能是因为温度升高，分子热运动加快，加快多酚浸出的速度。多酚得率在55 ℃时达到最大值，当超声温度从55 ℃升高到60 ℃时，多酚得率随温度升高而减小。出现这种现象可能是因为植物多酚对高温环境比较敏感，60 ℃的超声温度过高，高温环境破坏部分青稞酒糟多酚的结构，同时高温环境会加速提取溶剂挥发，影响提取的料液比，从而导致青稞酒糟多酚得率降低。因此选择40、45、50、55 ℃进行正交试验。

2.1.2.4 料液比对多酚得率的影响

多酚类物质为多羟基化合物，这类物质能溶于水，易溶于乙醇，但由于水中存在部分溶解氧，容易导致多酚类物质的氧化，影响多酚的抗氧化能力，因此选择乙醇作为提取溶剂。料液比对多酚得率的影响见图5。

图5 料液比对多酚得率的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on yield of polyphenols

由图5 可知，当溶剂添加量逐渐增加，多酚得率逐渐增大，但料液比1 ∶25（g/mL）时的多酚得率较1 ∶20（g/mL）增幅较小，提取时使用的溶剂量过多，提取液中会溶解更多杂质，为避免溶剂浪费，提高提取液中多酚类物质的纯度，所以选择1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20（g/mL）进行正交试验。

2.1.3 正交试验结果与分析正交试验结果和差异性分析见表2 和表3。

表2 正交试验结果与分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

续表2 正交试验结果与分析Continue table 2 Orthogonal test results and analysis

表3 差异性分析Table 3 Difference analysis

由表2 可知，不同提取因素对青稞酒糟多酚得率影响程度不同，在4 种因素中料液比对多酚得率的影响最大。由表3 可知，超声功率的P值小于显著水平，说明不同超声功率在青稞酒糟多酚得率上存在显著差异，料液比的P值小于极显著水平（0.01），说明不同料液比提取的青稞酒糟多酚得率差异极显著。

在最优提取工艺A2B2C4D4下，即超声功率400 W、超声温度45℃、超声时间50 min、料液比1 ∶20（g/mL），多酚的得率为（3.337 1±0.149 8）mg/g，与朱俊玲等[16]相比多酚的提取率提高了1.8 倍左右，与夏陈等[21]的研究结果相比提高了2 倍。出现这种现象的原因可能是不同品种的青稞以及青稞栽种环境影响了青稞中的多酚含量，同时有研究发现青稞经过发酵处理后，在微生物的代谢产物作用下，游离酚和结合酚的含量均增加[22]。还有研究表明，不同的酿酒工艺也会影响青稞酒糟中多酚的含量，导致多酚得率的改变[12]。

2.2 青稞酒糟多酚的体外抗氧化试验

2.2.1 对DPPH·的清除效果

不同浓度青稞酒糟多酚对DPPH·的清除效果见图6。

图6 不同浓度青稞酒糟多酚对DPPH·的清除效果Fig.6 DPPH·scavenging effects of polyphenols at different concentrations

由图6 可知，当青稞酒糟浓度为21 μg/mL 时，对DPPH·的清除率最高，为（83.76±1.35）%，表明青稞酒糟多酚对DPPH·有良好的清除效果。与黄酒糟[23]和其他白酒酒糟[24]相比，青稞酒糟多酚对DPPH·的清除效果更好，但茶酒糟多酚对DPPH·的清除效果优于青稞酒糟多酚[25]。可能是因为多酚类物质的来源不同，导致提取液中酚类物质种类及含量不同，影响对DPPH·的清除效果。即所使用的谷物类型可能对酚类成分和抗氧化特性产生至关重要的影响[26]。

2.2.2 对·OH 的清除效果

不同浓度青稞酒糟多酚对·OH 的清除效果见图7。

图7 不同浓度青稞酒糟多酚对·OH 的清除效果Fig.7 ·OH scavenging effects of polyphenols at different concentrations

由图7 可知，青稞酒糟多酚表现出较强的抗氧化性，经计算得出青稞酒糟多酚对·OH 的IC50为14.79 μg/mL，在相同质量浓度下，青稞酒糟多酚对·OH 的清除率高于青稞多酚[27]，出现这种现象可能是因为发酵青稞比未发酵青稞的·OH 的清除效果更好，发酵过程中受微生物种类的影响，多酚化合物的种类和含量出现了明显变化，导致抗氧化能力改变。同时已有试验证明，经过微波处理的BSG 会产生具有高抗氧化活性的美拉德反应产物，即羟基肉桂酸的衍生物，对·OH 的清除具有积极效果[28]。

2.2.3 对·O2-的清除效果

多酚类化合物中对·O2-起主要清除作用的是A环和B 环上的羟基，其中邻位羟基具有更好的清除能力[29]。不同浓度青稞酒糟多酚对·O2-的清除效果见图8。

图8 不同浓度青稞酒糟多酚对·O2-的清除效果Fig.8 ·O2-scavenging effects of polyphenols at different concentrations

由图8 可知，多酚提取物的抗氧化能力与提取物中的总酚含量呈正相关。当青稞酒糟多酚浓度为21 μg/mL 时，·O2-清除率为（76.88±1.47）%。对·O2-的清除效果优于甘蔗叶多酚[30]，原因可能是不同结构的多酚化合物对·O2-的清除能力不同，通过不同方法提取的多酚对·O2-的清除效果也存在差异。

3 结论

本试验以青稞酒糟为原料，通过单因素试验结合正交试验优化青稞酒糟多酚超声波辅助提取工艺，最优提取工艺为超声功率400 W、超声温度45 ℃、超声时间50 min 和料液比1 ∶20（g/mL），在该条件下青稞酒糟多酚的得率为（3.337 1±0.149 8）mg/g。进一步检测不同浓度青稞酒糟多酚对DPPH·、·OH 和·O2-的清除效果，清除效果随浓度增大而提高，当青稞酒糟多酚浓度为21 μg/mL 时，对DPPH·的清除率为（83.76±1.35）%，对·OH 的清除率为（52.05±2.09）%，对·O2-的清除率为（76.88±1.47）%。

综上所述，本试验初步探索了青稞酒糟多酚的提取方法及其工艺优化，但青稞酒糟多酚的作用机理和功效仍需进一步研究与探索，对其应用潜力进行充分地挖掘，将为青稞酒糟多酚应用提供新方向，对新产品的研发产生深远影响，推动实现青稞酒糟的高值化利用。