枯草杆菌蛋白酶水解对大豆蛋白肽谱变化规律的影响

焦艳玲，陶晓露，许伟洲，于文娟，路福平，王洪彬

（天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

大豆蛋白是世界上最具价值的植物蛋白之一，可以提供人类所有的必需氨基酸，是人类补充蛋白质的良好来源。但是大豆蛋白中含有胰蛋白酶抑制剂，易引起消化不良、胃胀气等不良反应。将大豆蛋白水解加工成大豆肽，不仅提高了其营养价值，而且产生的多肽具有多种生理功能，包括抗肥胖、调节肠道微生物群、降血脂和降血糖等。大豆蛋白包含多种蛋白质成分，按照沉降系数的差异进行分类，主要分为分子量340～375 kDa 的11S 球蛋白（β-大豆球蛋白）和分子量140～170 kDa 的7S 球蛋白（β-大豆伴球蛋白），两者碱性条件下易溶解，约占蛋白总量的70%，其中β-大豆球蛋白含量最高，占蛋白质总量的52%[1-3]。大豆蛋白加工成大豆肽，常用的方法是酸碱水解法和酶解法。虽然酸碱水解法简单操作、成本较低，但使用酸碱水解法处理不仅改变了水解物的外观、溶解性、风味，而且在食品安全性上也存在诸多问题。因此，大豆蛋白水解主要采用安全温和、环境友好的酶解法来代替酸碱水解法[4-6]。

芽孢菌来源的枯草杆菌蛋白酶，耐碱性好，且具有极强的水解能力，是应用最广泛的碱性蛋白酶制剂种类，也是大豆蛋白水解的主要用酶[7]。关于碱性蛋白酶水解大豆蛋白生产大豆肽的研究，以往主要集中在水解条件优化和产品性能评价上[8-10]，对水解过程中肽谱的动态变化及其规律研究较少。解析水解过程中肽谱的变化规律，有助于获得酶水解底物蛋白氨基酸序列时位点选择倾向性等信息[11-13]。目前对蛋白质酶切肽谱的分析方法主要是基于质谱的蛋白质组学分析方法[14-15]。对于大豆蛋白水解多肽的研究，近年来主要关注的是发掘水解后产生的新肽及其功能。Torres 等[16]通过基质辅助激光解析-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）研究了萝藦蛋白酶水解胰岛素B 链的动态过程，从而揭示了该酶的底物特异作用位点，最终利用该酶降解大豆蛋白组分并探究了产物的功能特性。Daliri 等[17]利用鼠李糖乳杆菌EBD1 发酵胃蛋白酶，并使用该酶水解大豆蛋白，通过质谱分析挖掘出水解产物中3 个血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的抑制肽，发现的新肽可以作为一种抗高血压功能食品的添加剂。Feng 等[18]通过质谱分析发现，碱性丝氨酸蛋白酶SF1 处理的大豆蛋白产生了4 个主要的亲水肽，有利于降低大豆蛋白水解产物的苦味。Reyes Jara 等[19]使用植物乳胶中提取的蛋白酶水解大豆蛋白，通过MALDI-TOF MS 分析和生物信息学分析，推导出14 个包含抗氧化氨基酸的理论肽序列。Taniguchi 等[20]使用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和MALDI-TOF MS在大豆蛋白水解物中纯化和鉴定出14 种多功能阳离子肽，并发现它们具有多种生物活性，如溶解血栓、中和脂多糖、抗菌等。Wu 等[21]用高效液相色谱纯化大豆多肽，并用MALDI-TOF MS 鉴定到一种新型大豆肽，该肽可改善高脂小鼠的胰岛素抵抗。但这些研究均未对酶法水解大豆蛋白所得肽谱的动态变化过程进行深入的解析，不利于大豆肽水解工艺的控制和新型大豆肽的发现。

枯草杆菌蛋白酶位点特异性较弱，因此其水解肽谱的鉴定不能使用蛋白质组学研究中常用的肽谱鉴定方法，而是应使用位点非特异性酶切肽谱的分析方法[22]。本研究使用高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间串联质谱（high performance liquid chromatographyelectrospray quadrupole time-of-flight mass spectrometry，HPLC/ESI-QTOF MS）检测枯草杆菌蛋白酶水解大豆蛋白肽谱，通过Mascot 软件使用位点非特异性酶切肽谱的鉴定方法解析肽谱的动态变化，以阐明水解过程中酶切位点氨基酸种类的选择倾向性和分布规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白（纯度90%）：上海源叶生物科技有限公司；枯草杆菌蛋白酶（活力8 540 U/mg，最适pH10.5，最适温度40 ℃）：天津市诺奥科技发展股份有限公司；乙腈、甲酸（均为色谱纯）：美国费希尔公司；硼酸钠（分析纯）、4×蛋白上样缓冲液（含巯基还原剂）：北京索莱宝科技有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；考马斯亮蓝染色液（R-250）、脱色液：武汉赛维尔生物科技有限公司；蛋白Marker（14.4～116.0 kDa）：北京百奥莱博科技有限公司；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（12%）、电泳缓冲液：金斯瑞生物科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪（1200-6450 型）：美国安捷伦公司；超纯水装置（Milli-Q）：美国密理博公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（Mini-PROTEAN Tetra）：美国伯乐公司；移液枪（eppendorf）：德国艾本德公司；凝胶成像仪（GenoSens2100）：上海勤翔科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

氢氧化钠溶液（10 mol/L）：取40 g 氢氧化钠于烧杯中，加入适量超纯水溶解，冷却后倒入100 mL 容量瓶中，超纯水定容至100 mL。

硼酸缓冲液（pH10.5）：硼酸钠9.45 g 加超纯水1 L，混匀，用氢氧化钠溶液调节pH 值至10.5±0.5。

水相：取1 mL 甲酸加入到999 mL 超纯水中。

有机相：取1 mL 甲酸加入到999 mL 乙腈中。

1.3.2 碱性蛋白酶水解大豆蛋白过程的电泳分析

使用硼酸缓冲液（pH10.5）溶解大豆分离蛋白，配制成浓度为1 g/L 的溶液。溶解好的大豆蛋白溶液中加入千分之一的枯草杆菌蛋白酶，40 ℃水浴条件下进行水解反应。分别在水解0、10、30、60、90、120、150 min时取样1 mL，取样后立即沸水浴5 min 使酶灭活，12 000 r/min 离心5 min 后取上清液，0.45 μm 针式滤器过滤处理后用于后续检测。将不同上清液分别与上样缓冲液按3 ∶1 的体积比混合，用移液枪吸取5 μL标准蛋白Marker 或10 μL 混合液分别加入到蛋白胶上样孔中，80 V 恒压电泳约15 min，然后120 V 恒压至电泳结束。电泳结束后取出蛋白胶至容器，使用考马斯亮蓝染色液染色1 h，脱色液脱色6 h。最后，使用凝胶成像仪拍摄蛋白胶图。

1.3.3 基于HPLC/ESI-QTOF MS 的肽谱检测

取枯草杆菌蛋白酶水解大豆蛋白不同时间获得的肽段样品，使用HPLC/ESI-QTOF MS 进行检测。色谱条件：色谱柱ZORBAX300SB（C18，5μm，2.1mm×150mm），流速0.2 mL/min，流动相变化梯度参考文献[22]，有机相0～5 min 保持3%，5～75 min 由3%上升至50%。质谱条件：正离子模式，雾化压力310 kPa，干燥气温度300 ℃，干燥气流速12 mL/min。一级质谱质荷比扫描范围300～1 000，二级质谱扫描范围100～1 200，动态排除条件为0.5 min 2 次。

1.3.4 位点非特异性酶切肽谱鉴定方法

使用Masshunter 工作站软件，将HPLC/ESI-QTOF MS 检测出的原始数据转换成mgf 格式，然后导入到Mascot 软件进行位点非特异性酶切肽谱鉴定，鉴定参数：蛋白质数据库选择Swissprot 来源的大豆蛋白数据库，酶种类选择“None”，母离子质量误差为±0.01%，子离子误差为±0.01%，肽段母离子电荷种类选择为1～3。

1.4 数据处理

根据Mascot 软件鉴定获得的肽段序列信息，使用Masshunter 软件通过提取离子流分析提取多肽丰度信息，在此基础上对所有肽段及酶切位点进行统计分析，并用Origin 软件作图。

2 结果与分析

2.1 枯草杆菌蛋白酶水解大豆蛋白过程的电泳分析

将枯草杆菌蛋白酶水解大豆蛋白不同时间点的产物，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，检测蛋白降解情况，结果如图1所示。

图1 枯草杆菌蛋白酶水解大豆蛋白不同时间点的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the soy protein hydrolyzed by subtilisin protease in different time periods

图1 第一泳道展示了未水解大豆蛋白样品的电泳条带，主要条带是7S 组分中的β-大豆伴球蛋白（α 亚基、α′亚基和β 亚基）和11S 组分中的β-大豆球蛋白（AS 亚基和BS 亚基）。与未水解样品的电泳图相比，水解10 min 时大豆蛋白中的多数蛋白质就已经被降解，显示了碱性蛋白酶对大豆蛋白超强的水解能力。随着水解时间的延长，前10 min 未完全降解的蛋白或长肽段也逐渐被降解。图1 中10～90 min 4 个泳道内出现的25 kDa 附近条带，推测是所添加的枯草杆菌蛋白酶，其分子量约为27 kDa。随着水解时间延长，酶的条带也逐渐变浅，说明在水解大豆蛋白过程中酶也在不断自切失去活性，120 min 和150 min 泳道内已经基本看不到酶的条带。枯草杆菌蛋白酶属于位点非特异性蛋白酶，且水解位点比较广泛，相较于位点特异性比较强的蛋白酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶等，枯草杆菌蛋白酶能够在更短的时间将底物蛋白切割成分子量大小不一的肽段。

2.2 酶切肽谱和氨基酸位点的动态变化

枯草杆菌蛋白酶水解大豆蛋白过程中，水解肽谱在不断发生变化。水解10、30、60、90、120 min 和150 min的样品，通过HPLC/ESI-QTOF MS 和位点非特异性肽谱分析方法鉴定水解肽谱，结果如图2所示。

图2 枯草杆菌蛋白酶水解大豆蛋白过程中多肽产物的动态变化Fig.2 Dynamic changes of polypeptide products during soybean protein hydrolysis by subtilisin protease

由图2（a）可知，水解30 min 鉴定到的肽段种类最多，随着水解时间的延长，可鉴定到的肽段种类数目不断下降，最后稳定在21 种肽段。肽段分子量过大或过小都会影响质谱的鉴定结果。随着水解程度的加深，一些肽段可能会被降解成更小的二肽、三肽，甚至是游离氨基酸，进而无法鉴定。由图2（b）可知，丰度最高的肽（N）ALPEEVIQH（T）来自于大豆球蛋白G1 亚基，其丰度在水解10～30 min 内上升，水解30～120 min 内缓慢下降，水解120～150 min 内保持平衡。肽段（G）SEEEDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQK（E）来自于β-伴大豆球蛋白，在10 min 和30 min 水解样品中并没有检测到，水解60 min 后其丰度变化的整体趋势为先升高后下降。肽段（A）GNPDIEHPETM（Q）、（V）EDLPEGPAVK（I）、（F）YVVNPDNDENLR（M）的丰度变化趋势大致相同，先升高后降低并在120～150 min 内保持平衡。不同种类肽段呈现不同的丰度变化趋势，这与肽段在水解过程中是否稳定存在很大关系，许多肽段只是中间产物，可能会被继续水解成更小片段。

枯草杆菌蛋白酶位点特异性较弱，酶切时可选择的位点较多，可切割几乎所有的常见氨基酸，但仍然展现了对特定氨基酸的切割偏向性。通过对枯草杆菌蛋白酶水解大豆蛋白所得肽谱的分析，可以进一步获知其水解位点选择的氨基酸种类、位置及相对水解强度。图3 分别展示了不同水解时间枯草杆菌蛋白酶对大豆蛋白的酶切位点的相对强度分布。

图3 枯草杆菌蛋白酶对大豆蛋白酶切位点的强度分布Fig.3 Intensity distribution of hydrolysis sites of the subtilisin protease on soy protein

由图3 可知，枯草杆菌蛋白酶具有宽泛的氨基酸水解位点选择性，可以水解近乎所有种类氨基酸的肽键。但不同种类氨基酸位点被酶切的相对频率明显不同。其中，酶切更倾向于发生在丙氨酸（A）和苏氨酸（T）的N 端，以及组氨酸（H）和天冬酰胺（N）的C 端。同一种氨基酸的C 端和N 端肽键被酶切的程度明显不同，如丙氨酸（A）和苏氨酸（T）的N 端肽键易被水解，而其C 端肽键几乎不被水解，而H、N 则相反，它们的C 端肽键易被水解，N 端肽键几乎不易水解。不同水解时间点枯草杆菌蛋白酶对大豆蛋白酶切位点的强度分布也不同，如组氨酸（H）和天冬酰胺（N）的C 端肽键在不同时间均易被水解，但不同时间点水解的相对强度不同。枯草杆菌蛋白酶更易切割C 端的组氨酸、天冬酰胺，N 端的苏氨酸和丙氨酸，其中组氨酸是杂环族氨基酸，苏氨酸、丙氨酸、天冬氨酸是脂肪族氨基酸，这说明枯草杆菌蛋白酶在水解大豆蛋白时更倾向于酶切杂环族氨基酸和脂肪族氨基酸的两端。

2.3 大豆蛋白主要水解肽的空间结构分布

随着枯草杆菌蛋白酶水解时间的延长，理论上由大豆蛋白水解肽组成的肽谱将最终趋于稳定。图4 为水解150 min 时检测到的大豆球蛋白G5 亚基5 种高丰度多肽在蛋白质空间结构上的分布。

图4 枯草杆菌蛋白酶酶切位点在大豆球蛋白空间结构上的分布Fig.4 Structure distribution of subtilisin protease cleavage on glycinin

由图4 可知，5 种肽均分布在蛋白结构的外围，这显示了蛋白酶酶切过程中，更易切割空间结构外部的位点，因此底物蛋白的空间结构对蛋白酶酶切效果有很大影响。

3 结论

枯草杆菌蛋白酶适合大豆蛋白的高效水解，可快速地制备多肽，筛选其中具有不同生物活性的肽段。针对其水解过程，本研究通过位点非特异性肽谱鉴定的方法，揭示了其水解肽谱的动态变化规律，并在此基础上分析了对大豆蛋白水解位点选择的倾向性，结果表明枯草杆菌蛋白酶在水解大豆蛋白时，更倾向于在大豆蛋白分子的组氨酸、天冬酰胺的C 端，苏氨酸和丙氨酸的N 端发生水解。本研究揭示的水解肽谱变化规律，有助于指导碱性蛋白酶在大豆蛋白水解中的理性应用和水解过程控制，提高主要植物源蛋白——大豆蛋白的水解加工水平。鉴于枯草杆菌蛋白酶的耐碱性和高效水解能力，它也非常适合于大米蛋白、花生蛋白等其他谷物蛋白的水解，因此本文也为研究碱性蛋白酶水解其他谷物蛋白肽谱提供了借鉴和参考。