膳食GM1对AD小鼠神经节苷脂代谢的调控作用

刘斌，王志高，王晓旭，马迎旭，丛培旭，宋雨，徐杰，薛长湖

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003）

神经节苷脂（gangliosides，GLS）是含有唾液酸的鞘糖脂类化合物，其中带负电荷的亲水聚糖头基与疏水性神经酰胺（ceramide，Cer）尾部相连[1]。糖链中糖组成和结构的变化与脂质部分的长度、饱和度和羟基化赋予了GLS 广泛的多样性，目前，已经发现了数百种GLS 分子种类[2]。GLS 高度集中在中枢神经系统（central nervous system，CNS）中，在记忆形成、神经发生、突触传递和其他神经功能中发挥重要作用，并与细胞识别、细胞信号传导以及离子通道调节等生物学功能密切相关[3]。研究表明GLS 的数量和种类在细胞分化过程中会发生变化[4]，鉴于内源性GLS 在神经方面的重要功能，对GLS 的定量分析显得十分必要。

单唾液酸四己糖神经节苷脂（monosialotetrahexosyl ganglioside，GM1）是CNS 中最丰富的一类GLS，存在于神经元和神经胶质细胞的质膜中[1]，具有调节离子转运、神经元分化、神经保护信号传导的作用[5]。研究发现，通过外源摄入GM1可改善氯胺酮诱导的大鼠认知障碍和海马细胞凋亡[6]；在体外神经干细胞中，GM1干预减轻了丙泊酚与瑞芬太尼诱导的神经毒性[7]，表明外源GM1在神经损伤和神经变性的体内外模型中展现出神经保护作用。随着GLS 在维持大脑认知功能的重要性日益显现，其膳食来源越来越被重视。GLS 存在于蛋、肉等动物源食品中[8]，其中哺乳动物的脑组织是GM1的重要来源，目前国内外主要从猪脑、牛脑等食用脑中进行提取和分离纯化[9]。

阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）是一类进行性神经退行性疾病，与神经元进行性丧失有关，主要症状是记忆和认知功能下降[10]。AD 在老龄化人群中患病率高，且暂无治愈的方法。在AD 体内外模型中，外源GM1表现出良好的神经保护作用[11-12]。淀粉样蛋白和人早老蛋白1（APPswe/PS1dE9，APP/PS1）双转基因小鼠携带嵌合的淀粉样蛋白前体蛋白和突变的人早老蛋白1，具有AD 的神经行为功能障碍[13]，是探究GM1对AD 作用的良好模型。AD 患者体内GLS 水平显著改变[14]，推测GLS 代谢的改变可能反映AD 的发病进程，与AD 发病机制有关，然而过往因技术受限无法精确定量。三重四极杆结合多级反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式能够靶向研究GLS 代谢，进而为预防与治疗AD 提供策略[15]。液相色谱-质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）能够对生物样本中GLS 进行准确的定量分析[16]。因此本研究采用APP/PS1 小鼠作为AD 模型，基于LC-MS 方法结合分子生物学手段，探究膳食GM1对AD 小鼠内源GLS 代谢的影响及机制，以期为GM1在食品和药品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPF 级APP/PS1 雄性小鼠以及同窝野生型雄性小鼠（C57BL/6J，5月龄，体重20～25 g）：北京唯尚立德生物科技有限公司。

冰冻猪脑：杭州慧康食品有限公司；氯仿、甲醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇、异丙醇（均为色谱级）：美国Thermo Fisher 公司；GM1、二唾液酸四己糖神经节苷脂（disialotetrahexosyl ganglioside，GD1）、三唾液酸四己糖神经节苷脂（trisialotetrahexosyl ganglioside，GT1）、四唾液酸四己糖神经节苷脂（tetrasialotetrahexosyl ganglioside，GQ1）标准品：美国Cayman Chemical 公司；氘代神经节苷脂d3-GM3：美国Avanti Polar Lipids 公司；ACQUITY UPLC BEH 液相色谱柱（150 mm×1 mm，1.7μm）：美国Waters 公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；OMEGA 总DNA/RNA/蛋白质共提取试剂盒：广州飞扬生物工程有限公司；5×All-In-One MasterMiX 逆转录试剂盒：美国Abcam 公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix 荧光定量试剂盒：武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

MED-VWM Morris 水迷宫装置：上海赞德仪器有限公司；Ultimate 3000 RSLCnano 液相系统、Nanodrop 2000 超微量分光光度计：美国Thermo Scientific 公司；4000Q TRAP 三重四极杆线性离子阱质谱仪：美国SCIEX 公司；iCycler iQ5 系统实时荧光定量聚合酶链式反应扩增仪：美国Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 猪脑中GM1的提取

参考孙玉[17]的方法，略作修改，冷冻猪脑解冻后用氯仿∶甲醇∶水体系（4 ∶8 ∶3，体积比）提取，搅拌后离心（4 ℃，30 min，2 000×g）后收集上清液，随后加水调整体系为氯仿∶甲醇∶水=4 ∶8 ∶5.6（体积比），离心（4 ℃，30 min，2 000×g）后取上清过Daisogel-SP120-C8 色谱柱（3.5 cm×20 cm，40～60 μm）脱盐，回收的神经节苷脂重新溶解在氯仿∶甲醇∶水（30 ∶60 ∶8，体积比）中，并于DEAE-Sephadex A25 色谱柱（1.7 cm×45 cm，40～120 μm）梯度洗脱，最后使用电喷雾电离-串联质谱进行鉴定，GM1纯度大于90%。

1.3.2 实验动物分组与受试

8 只C57BL/6J 小鼠和16 只APP/PS1 小鼠适应性喂养7 d 后，分为3 组（n=8），正常组：C57BL/6J 小鼠，饲喂AIN-93G 标准饲料；模型组：APP/PS1 小鼠，饲喂AIN-93G 标准饲料；GM1组：APP/PS1 小鼠，饲喂AIN-93G 标准饲料+50 mg/（kg·d）GM1。所有小鼠实行双水瓶喂养，保证有足够的活动空间，持续喂养3 个月后进行各项指标的检测。所有程序在中国海洋大学动物伦理委员会批准的协议基础上进行。

1.3.3 Morris 水迷宫行为学分析

水迷宫中加入白色素钛白粉，水温设定为（22±1）℃。将水迷宫分为4 个象限，平台放置在任一象限中点并淹没在水面下方约1 cm 的位置。定位航行实验中首先训练所有小鼠经过4 条路径找到平台，每个实验日将小鼠放置在水池中开始寻找试验。记录小鼠找到平台的时间即为逃逸潜伏期，若逃逸潜伏期超过60 s则记为60 s。最后一天进行空间探索测试：移出平台，小鼠在泳池内自由游泳60 s，记录小鼠在目标象限停留的时间及穿越平台位置的次数。

1.3.4 小鼠脑皮质中神经节苷脂的提取

基于Svennerholm 等[18]的方法进行神经节苷脂的提取。取小鼠脑皮质，添加9 倍体积超纯水，冷冻研磨配制成10%组织匀浆液。根据BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白含量，吸取等量蛋白含量对应的组织匀浆液，利用超纯水调整至相同体积。加入20 倍体积的氯仿∶甲醇（1 ∶2，体积比）和氘代内标涡旋振荡，离心（4 ℃、20 min、2 000×g）取上层清液，加水调整溶剂体系至氯仿∶甲醇∶水为4 ∶8 ∶5.6（体积比），离心（4 ℃、20 min、2 000×g）收集上层水相即得到神经节苷脂粗提物。氮气吹干后重新溶解在氯仿∶甲醇∶水（30 ∶60 ∶8，体积比）中，并于DEAE-Sephadex A25 色谱柱（6 mm×45 mm）梯度洗脱。

1.3.5 LC-MS 法分析小鼠脑皮质中神经节苷脂

基于Ikeda 等[19]的方法，采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱检测皮质中的神经节苷脂，样品在C18 柱（150 mm×0.3 mm）上分离。流速为7.5 μL/min，柱温为45 ℃。流动相由流动相A：甲醇∶异丙醇∶水（55 ∶25 ∶20，体积比），200 mmol/L 乙酸铵和流动相B：甲醇∶异丙醇∶水（60 ∶40，体积比）组成。梯度洗脱程序：0～5 min，A；5～50 min，B；35 min，B。使用电喷雾离子源，在负离子模式下进行MRM 扫描，范围为m/z200～2 300，喷雾电压为-4 500 V。标准品GM1、GD1、GT1和GQ1的碰撞诱导解离（collision induced dissociation，CID）分别为-95、-55、-60、-60 eV。生物样本中的GLS采用与GLS 标准品结构相近的CID 进行检测。

1.3.6 神经节苷脂代谢通路相关基因mRNA 表达水平检测

采用OMEGA 总DNA/RNA/蛋白质共提取试剂盒从小鼠皮质中提取RNA，Nanodrop 分光光度计测定RNA 浓度后使用5×All-In-One MasterMiX 试剂盒将RNA 逆转录成cDNA，加入2×SYBR Green qPCR Master Mix 和上下游引物后对目的基因进行实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）。以β-肌动蛋白作为内参，使用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达水平。使用的引物序列如表1所示。

1.4 数据处理与统计分析

脂质数据由Agilent MassHunter Quantitative Analysis 软件分析，使用内标校正的外标曲线对GLS 进行定量分析。所有数据表示为平均值±标准差。由Graphpad prism 8.0 作图和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 GM1 对APP/PS1 小鼠行为学的影响

采用Morris 水迷宫观测分析GM1对APP/PS1 小鼠空间学习与记忆能力的作用，结果见图1。

图1 GM1 对APP/PS1 小鼠行为学的影响Fig.1 Effect of GM1 on the behaviors of APP/PS1 mice

AD 小鼠存在学习与记忆障碍，显著的行为学特征是定向失常和运动记忆缺陷，由图1A 可知，第1 天到第5 天正常组小鼠逃逸潜伏期逐渐降低，第5 天模型组小鼠与正常组小鼠的逃避潜伏期差异高度显著（p＜0.001），表明APP/PS1 小鼠的空间学习能力受损；GM1干预小鼠与模型组小鼠相比逃避潜伏期高度显著降低（p＜0.001），表明GM1改善了APP/PS1 小鼠的空间学习能力。由图1B～图1D 可知，在空间探索试验中，模型组小鼠穿越平台次数及在目标象限停留时间与目标象限停留时间百分比与正常组相比均高度显著下降（p＜0.001），在GM1干预下，APP/PS1 小鼠的穿越平台次数、目标象限停留时间及百分比高度显著增加（p＜0.001）。表明GM1高度显著改善了APP/PS1 小鼠的记忆能力。与Yang 等[20]的研究结果一致，表明外源GM1具有缓解AD 病症的作用，对认知功能产生了积极影响。

2.2 GM1 对APP/PS1 小鼠脑皮质GLS 组成的影响

GLS 分类：按照Cer 中不饱和键数量，分为饱和脂肪酸GLS（saturated fatty acid-gangliosides，SFA-GLS）、单不饱和脂肪酸GLS（monounsaturated fatty acid-gangliosides，MUFA-GLS）和多不饱和脂肪酸GLS（polyunsaturated fatty acid-gangliosides，PUFA-GLS）；根据链长分类，包括长链脂肪酸GLS（long chain fatty acid-gangliosides，LCFA-GLS）和超长链脂肪酸GLS（very long chain fatty acid-gangliosides，VLCFA-GLS）；根据外部唾液酸羟基是否被乙酰化，可分为非乙酰化GLS（non-O-acetylation-gangliosides，non-OAc-GLS）和乙酰化GLS（O-acetylation-gangliosides，OAc-GLS）。LC-MS 分析小鼠脑皮质中GLS 水平情况见表2。

表2 GM1 对APP/PS1 小鼠脑皮质神经节苷脂含量的影响Table 2 Effects of GM1 on the contents of ganglioside in the cortex of APP/PS1 mice μg/mg 蛋白

GLS 水平的降低和特定GLS 相对丰度的变化可能在AD 中发生[21]。如表2所示，模型组总GLS 含量高度显著下降（p＜0.001）。GM1组总GLS 含量高度显著提高（p＜0.001）。

正常组小鼠以碳链组成为C36：1 和C38：1 的MUFA-GLS 为主，占总GLS 含量的59.6%。其次为SFA-GLS，最后为PUFA-GLS。与正常组相比，模型组中MUFA-GLS 和SFA-GLS 含量高度显著降低（p＜0.001），GM1受试具有高度显著回调作用（p＜0.001）。相较于正常组，模型组小鼠的PUFA-GLS 含量极显著升高（p＜0.01），GM1干预有显著降低作用（p＜0.05）。

由表2 可知，正常组小鼠中绝大多数以LCFA-GLS为主，占总GLS 含量的99.2%。模型组中LCFA-GLS和VLCFA-GLS 含量均高度显著下降（p＜0.001），摄食GM1后LCFA-GLS 含量高度显著上调（p＜0.001），VLCFAGLS 含量显著升高（p＜0.05）。乙酰化会导致GLS 的生理性质发生重大变化，正常组中non-OAc-GLS 和OAc-GLS 两种GLS 含量水平相当。与正常组相比，模型组中non-OAc-GLS 和OAc-GLS 含量均高度显著降低（p＜0.001），GM1干预有高度显著回调作用（p＜0.001）。这与Fukami 等[14]的研究结果一致，AD 模型中的多数GLS含量降低，但外源GM1能够恢复GLS 总含量，并对不同饱和度、链长与乙酰化的GLS 含量展现出显著的调控效果。

利用LC-MS 对不同亚类的GLS 进行考察，结果见表3。

表3 GM1 对APP/PS1 小鼠脑皮质神经节苷脂亚类量的影响Table 3 Effects of GM1 on the content of ganglioside subclass in the cortex of APP/PS1 mice μg/mg 蛋白

由表3 可知，共检测到19 个亚类GLS，根据唾液酸数量可以分为5 类。单唾液酸GLS 包括GM1a和GM3，与正常组相比，模型组中GM1a和GM3含量均高度显著上调（p＜0.001），摄入GM1能够调控二者含量下降，回归到正常组水平。双唾液酸GLS 包括7 种GLS亚类。除GD1b和GD2以外，与正常组相比，APP/PS1 小鼠中双唾液酸GLS 含量趋于减少，经GM1干预后趋于升高，其中在GD1a、GD3和OAc-GD1b中调控效果高度显著（p＜0.001）。三唾液酸GLS 包括4 种GLS 亚类，其中GT1b和di-OAc-GT1b含量在模型组小鼠中高度显著下降（p＜0.001），GM1干预后GT1b 含量高度显著上调（p＜0.001），di-OAc-GT1b含量极显著升高（p＜0.01）。同样在四唾液酸GLS 和五唾液酸GLS 组成中，与正常组相比，模型组小鼠GLS 含量高度显著降低（p＜0.001），GM1干预后将其恢复至正常水平。总的来说，在APP/PS1 小鼠皮质中，简单GLS（GM1a和GM3）水平有所增加，复杂GLS 趋于减少，而摄食GM1逆转了这一变化。

2.3 GM1 对APP/PS1 小鼠脑皮质中GLS 分子种的影响

GM1对APP/PS1 小鼠脑皮质中GLS 分子种的影响见图2。

图2 GM1 对APP/PS1 小鼠脑皮质中GLS 分子种的影响Fig.2 Effect of GM1 on GLS molecular species in the cortex of APP/PS1 mice

分层聚类分析结果表示不同组间GLS 的变化情况，由图2A 可知，与正常组相比，模型组的GLS 水平显著变化，而摄食GM1能部分改善其水平。为了进一步研究正常组和模型组之间的GLS 差异，火山图分析被用来筛选脂类生物标志物。用≥1 或≤-1 的log2（FC）值区分两组的GLS 种类。由图2B 可知，模型组中4 种GLS 分子种发生了显著上调，包括GM1（38：1）、GD1-GalNAc（36：2）、GD1a（40：2）、GD1a（42：3），它们可能是AD 潜在病理变化的重要生物标志物。

2.4 GM1 对APP/PS1 小鼠GLS 代谢通路的影响

采用RT-qPCR 测定GLS 合成及分解基因的mRNA 表达水平，结果见图3。

图3 GM1 对APP/PS1 小鼠GLS 合成及分解基因的mRNA 表达水平的影响Fig.3 Effect of GM1 on mRNA levels of genes involved in GLS synthesis and catabolism in APP/PS1 mice

唾液酸和糖基的组装与转移对GLS 合成起关键作用，st3gal5、st8sia1、b4galnt1、b3galnt4、st3gal2和soat是编码糖基转移酶和唾液酸乙酰酯酶的基因[22-23]，如图3A所示，与正常组相比，模型组小鼠脑皮质中除b4galnt1外，其余GLS 合成基因mRNA 水平趋于降低，其中st3gal5、st8sia1极显著降低（p＜0.01），GM1干预后的mRNA 水平均高度显著回升（p＜0.001），从而促进GLS含量升高，与LC-MS 检测结果相吻合。soat和siae分别促进与抑制OAc-GLS 的生成[22]。由图3A 和图3B可知，与正常组相比，模型组中soat和siae基因mRNA水平均有所下降，其中soat的mRNA 水平显著降低（p＜0.05），经GM1干预后，两种基因的mRNA 水平有所回升，soat基因表达水平上调高度显著（p＜0.001），表明GM1摄入能够活跃OAc-GLS 代谢过程，且趋向于OAc-GLS 的合成。由图3B 可知，在GLS 分解的基因g1b1、hexa、siae中，摄食GM1后，hexa基因的表达水平高度显著下调（p＜0.001），与Okuda 等[24]的结果一致，hexa基因mRNA 水平的降低阻碍了复杂GLS 的降解，进一步佐证了LC-MS 分析的结果。推测APP/PS1小鼠摄食GM1经消化吸收后，促进GLS 合成，进而穿越血脑屏障[25]，到达大脑中枢神经系统对AD 起调控作用。

3 结论

本研究对摄食GM1的AD 小鼠内源性GLS 的代谢调控机制进行研究，结果表明，GM1通过维持GLS代谢平衡进而缓解AD 病症。首先行为学的结果表明摄食GM1可以改善APP/PS1 小鼠的空间学习与记忆障碍。其次，针对GM1的外源干预探究内源性GLS 的变化规律，通过LC-MS 检测分析发现模型组小鼠脑皮质GLS 总含量与多数复杂GLS 趋于减少，GM1回调GLS总水平与亚类水平。进一步对GLS 分子种的分析发现，较正常组相比模型组小鼠脑皮质GLS 分子种发生明显变化，GM1部分改善了这些变化，其中4 种GLS分子种被鉴定为AD 的潜在生物标志物。LC-MS 的结果表明GLS 作为控制神经元功能的重要角色参与了AD的病理过程，GM1具有缓解GLS 水平异常的作用。最后，借助RT-qPCR 分析GM1调控GLS 代谢机制中发现，GM1摄入能够促进GLS 合成和抑制GLS 分解，从而调控APP/PS1 小鼠脑皮质中GLS 代谢，并进一步印证了上述GLS 的水平变化。

综上所述，膳食GM1能显著提高APP/PS1 小鼠的空间学习与记忆能力，改善效果与回调脑皮质中GLS水平密切相关，其机制可能是促进GLS 合成代谢。本研究可为GM1在功能性食品、药品领域的应用提供一定的理论参考。