滇橄榄多酚氧化酶提取工艺优化及抑制剂筛选

资璐熙，赵紫梦，刘涵雨，孙蓉，郭磊

（西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224）

滇橄榄（Phyllanthus embicaL.）又名余甘子、青果，为橄榄科橄榄属植物的果实，栽植面积广，产率高，是一种生长于我国亚热带、热带部分地区的独特植物资源[1]。滇橄榄广泛分布于我国南方的多个省区，其在福建和云南产量居多[2]。滇橄榄果实风味独特，食用时先酸涩而后甘甜爽口[3]，同时，其含有丰富的营养成分，如维生素、氨基酸、蛋白质、多酚以及能够有效清除自由基，具有良好抗氧化作用的多糖、没食子酸等多种物质[4-6]。因此，表现出良好的药用价值，具有润肺化痰、清热利咽、健胃消食等功效，以及抗氧化、防衰老和抗菌消炎等活性功能。此外，研究发现橄榄对神经炎症相关疾病也有较好疗效[7-8]。目前，滇橄榄的副产品种类少，主要是以加工成果脯制品和罐头制品为主，在一定程度上造成了资源浪费，经济效益不佳。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是导致滇橄榄果实发生褐变的重要酚类氧化物之一。PPO 是一类含铜的氧化还原酶，广泛存在于植物体内，它的存在与植物组织的褐变有直接关系，PPO 活性越高，越容易发生酶促褐变[9-10]。PPO 的存在对滇橄榄有很大的影响，除了滇橄榄果实的颜色会发生变化，还会破坏滇橄榄的风味和活性成分，严重制约了滇橄榄的加工和副产品的开发，降低了经济效益。因此，抑制PPO 的酶促反应已成为讨论热点[11]。食品生产中常用的一种加工方式为热处理，一般来说，食品中的酶多是热敏性的蛋白质，当达到一定温度时，蛋白质会发生变性使酶失活。但在加热过程中，多酚、黄酮和VC等热敏性的营养物质会遭到破坏，此外，高温作用会造成食品色、香、味及形态的劣变，因此，该方法具有一定的局限性[12]。国内外对果蔬中PPO 的提取和抑制的研究深入且广泛，包括香蕉、芒果、茶叶等[13]，而对滇橄榄中PPO 的相关研究鲜见报道。

本试验通过单因素试验和响应面对滇橄榄中PPO的提取工艺进行优化，并在此基础上探讨不同酶抑制剂种类、浓度、温度和时间对滇橄榄中PPO 活性的影响，筛选出适合滇橄榄PPO 的抑制剂及作用条件，以期为滇橄榄果实在加工过程中多酚氧化酶的褐变提供一定的理论基础，为滇橄榄的开发利用提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

滇橄榄：市售；磷酸氢二钾：天津市光复科技发展有限公司；三水合磷酸二氢钾、氯化钙、乙二胺四乙酸二钠（disodium ethylenediamine tetraacetate-2Na，ED TA-2Na）、明矾：广东光华科技股份有限公司；无水亚硫酸钠：四川西陇化工有限公司；柠檬酸亚锡二钠、D-异抗坏血酸、多聚磷酸钠、邻苯二酚、愈创木酚：上海麦克林生化科技有限公司；30%过氧化氢：天津市风船化学试剂科技有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计（UV-VIS300）：美国Thermo Fisher 公司；高速离心机（5805ZR361607）：德国艾本德股份公司；数显电子恒温水浴锅（HH-2）：金坛市天瑞仪器有限公司；笔型pH 计（PHB-1）：上海世诺物理光学仪器有限公司；电子天平（BAS2245）：德国Strtorius 集团；电冰箱（BCD-215KS）：青岛海尔股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 滇橄榄的预处理

将新鲜、无害的滇橄榄洗净去核，称取20 g 滇橄榄果肉于研钵中匀浆，滇橄榄和研钵需先预冷至4 ℃。

1.3.2 滇橄榄粗酶液制备

参照谢倩等[9]的制备方法并作一定调整，在研钵中继续加入预冷至4 ℃的pH7.9 的磷酸盐缓冲溶液80 mL，在4 ℃低温下，研磨混匀得到匀浆液并浸提1.5 h。将浸提后的混合液置于高速离心机中进行离心（4 ℃、10 000 r/min、10 min），弃渣取上清液得粗酶液，在4 ℃下储藏备用。

1.3.3 PPO 酶活力测定

参照俞露等[14]的测定方法并作适当调整，以邻苯二酚为底物，在0.5 mL 邻苯二酚中加入2.3 mL pH7.9的磷酸盐缓冲溶液和0.2 mL 粗酶液，并从PPO 粗酶液加入后开始，每隔10 min 测定1 次吸光值，空白组用等量的磷酸盐缓冲液代替粗酶液。吸光值均在410 nm下进行测量，以每毫升酶液反应后每分钟吸光值变化0.01 为一个酶活力单位（U）。PPO 酶活力按照公式（1）进行计算。

式中：Q为PPO 酶活力，U/（g·min）；ΔA410为反应时间内在410 nm 下测量的吸光度变化量；VT为PPO粗酶液总体积，mL；W为新鲜滇橄榄质量，g；Vs为测定时取用酶液体积，mL；t为反应时间，min。

1.3.4 滇橄榄PPO 提取的单因素试验

1）磷酸盐缓冲液pH 值对滇橄榄PPO 酶活力的影响：将磷酸盐缓冲溶液的pH 值分别调至6.0、6.2、6.4、6.6、7.0、7.2、7.6、7.8、8.0，在液料比4.0 ∶1（mL/g）、浸提时间1 h、反应时间8 min、底物浓度0.2 mol/L、反应温度80 ℃的条件下，进行单因素试验，按照公式（1）计算PPO 酶活力，分析磷酸盐缓冲液pH 值对滇橄榄PPO酶活力的影响。

2）液料比对滇橄榄PPO 酶活力的影响：选取最佳磷酸盐缓冲液pH 值，控制反应体系液料比分别为1.0 ∶1、1.5 ∶1、2.0 ∶1、2.5 ∶1、3.0 ∶1、3.5 ∶1、4.0 ∶1、4.5 ∶1（mL/g），在浸提时间为1 h、反应时间为8 min、底物浓度为0.2 mol/L、反应温度为80 ℃的条件下分别反应，用公式（1）计算PPO 酶活力，研究液料比对滇橄榄PPO 酶活力的影响。

3）浸提时间对滇橄榄PPO 酶活力的影响：选取上述试验得到的最佳磷酸盐缓冲液pH 值、最佳液料比，控制浸提时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，分别在反应时间为8 min、底物浓度为0.2 mol/L、反应温度为80 ℃的条件下试验，按照公式（1）计算PPO 酶活力，得出最佳浸提时间。

4）反应时间对滇橄榄PPO 酶活力的影响：总反应体系在上述试验中得到的最佳磷酸盐缓冲液pH 值、液料比、浸提时间以及底物浓度为0.2 mol/L、反应温度为80 ℃的条件下，分别反应2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 min 后，用公式（1）计算PPO 酶活力，分析反应时间对滇橄榄PPO 酶活力的影响。

5）底物浓度对滇橄榄PPO 酶活力的影响：分别配制浓度为0.004、0.010、0.020、0.100、0.150、0.200、0.250、0.300 mol/L 的邻苯二酚溶液为底物，在以上最佳试验条件和反应温度80 ℃下分别反应，用公式（1）计算PPO酶活力，探究底物浓度对滇橄榄PPO 酶活力的影响。

6）反应温度对滇橄榄PPO 酶活力的影响：在以上试验得出的最佳条件下，控制反应体系温度分别为20、30、35、42、45、50、55、57、60、65、70、75、80、90、100 ℃，用公式（1）计算酶活力，研究反应温度对滇橄榄PPO 酶活力的影响。

1.3.5 响应面优化滇橄榄PPO 提取工艺的试验

在单因素试验结果的基础上，对影响较大的3 个因素进行进一步分析，并采用Box-Behnken 中心试验设计，分析3 个因素对滇橄榄PPO 酶活力的影响，响应面试验设计因素水平见表1。

表1 响应面试验设计因素水平Table 1 Factors and levels of response surface test design

1.3.6 滇橄榄PPO 抑制剂的筛选试验

1）不同抑制剂种类对滇橄榄PPO 酶活力的影响：将无水亚硫酸钠、氯化钙、EDTA-2Na、明矾、柠檬酸亚锡二钠、D-异抗坏血酸、多聚磷酸钠分别配制成0.6 g/L的溶液，在最佳提取工艺条件下，取3 mL 制备得到的抑制剂溶液反应8 min，按照公式（1）计算酶活力，整理数据并分析结果。

2）不同抑制剂浓度对滇橄榄PPO 酶活力的影响：选取抑制效果最佳的抑制剂，将其配制成质量浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 的溶液，在最佳提取工艺条件下，取3 mL 制备得到的抑制剂溶液反应8 min，用公式（1）计算酶活力，分析抑制剂浓度的差异对滇橄榄褐变抑制作用的影响。

3）抑制温度和抑制时间对滇橄榄PPO 酶活力的影响：在最佳提取工艺条件下，在粗酶液中加入抑制剂后得到的样品溶液分别置于25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80 ℃的恒温下反应，每隔10 min 测定吸光值直至180 min，用公式（1）计算酶活力，探究抑制温度和抑制时间对滇橄榄PPO 酶活力的影响。

1.4 数据处理

采用Excel 2016、IBM SPSS Statistics 25 统计软件进行数据分析，Design-Expert 13 进行响应面分析。运用Origin 2021、GraphPad Prism 8 软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 磷酸盐缓冲液pH 值对滇橄榄PPO 酶活力的影响

磷酸盐缓冲液pH 值对滇橄榄PPO 酶活力的影响如图1所示。

图1 磷酸盐缓冲液pH 值对酶活力的影响Fig.1 Effect of phosphate buffer pH on PPO enzyme activity

由图1 可知，滇橄榄PPO 酶活力对缓冲液pH 值变化敏感。当磷酸盐缓冲液pH 值为6.0～7.8 时，PPO酶活力总体呈现上升趋势，但在此过程中酶活力有较小的起伏。当磷酸盐缓冲液pH7.8 时，滇橄榄PPO 酶活力出现峰值，为23.563 U/（g·min）。随着磷酸盐缓冲液pH 值继续增大，PPO 活力下降。其原因为PPO 的辅基是Cu2+，在酸性条件下PPO 酶酶活性中心的Cu2+容易解离出来使酶失活；在碱性条件下PPO 中的Cu2+解离后易生成Cu（OH）2沉淀，脱离酶蛋白，从而使得酶活力下降[15]。

2.1.2 液料比对滇橄榄PPO 酶活力的影响

液料比对滇橄榄PPO 酶活力的影响如图2所示。

图2 液料比对PPO 酶活力的影响Fig.2 Effect of liquid -to- feed ratio on PPO enzyme activity

由图2 可知，滇橄榄PPO 酶活力随溶剂体积的增大而变化。在液料比为1.0 ∶1～3.0 ∶1（mL/g）之间时，PPO 酶活力在一定范围内起伏，但总体来说其酶活力较低。其原因是在料液比较低的条件下，滇橄榄中的PPO 无法充分溶出，提取不充分[16]。当液料比大于3.0 ∶1（mL/g）后，PPO 酶活力随溶剂体积的增加而增大，直至液料比为4.0 ∶1（mL/g）时，PPO 酶活力达到最大值，为17.416 U/（g·min）。随着溶剂体积逐渐增大，酶活力急剧下降。这可能是因为PPO 酶溶解量不再增大，但溶剂仍在变多而导致PPO 提取液被稀释，影响PPO 酶活力的测定[17]。

2.1.3 浸提时间对滇橄榄PPO 酶活力的影响

浸提时间对滇橄榄PPO 酶活力的影响如图3所示。

图3 浸提时间对PPO 酶活力的影响Fig.3 Effect of extraction time on PPO enzyme activity

从图3 中可以看出，滇橄榄PPO 酶活力随着浸提时间的延长先明显增加又缓慢降低。在浸提时间0.5～1.0 h 内，PPO 酶活力增长速度最快，并在浸提时间为1.5 h 时，PPO 酶活力达到峰值，为24.25 U/（g·min）。此后，随着浸提时间的延长，酶活力缓慢下降。原因是在一定范围内，浸提时间延长有助于酶蛋白溶解出来，但当其达到最大量后，再继续浸提会使在液态中构象不稳定的酶蛋白发生水解，导致酶量减少，表现出酶活力降低[18]。

2.1.4 反应时间对滇橄榄PPO 酶活力的影响

反应时间对滇橄榄PPO 酶活力的影响如图4所示。

图4 反应时间对PPO 酶活力的影响Fig.4 Effect of reaction time on PPO enzyme activity

由图4 可知，反应时间从2 min 开始，滇橄榄PPO酶活力随反应时间的延长而增加，特别是反应时间在6～8 min 之内，其酶活力急剧增大，并在反应时间8 min时达到峰值，为3.5 U（/g·min）。随后酶活力呈整体下降趋势，并在12 min 以后酶活力变化较小，基本呈稳定状态。

2.1.5 底物浓度对滇橄榄PPO 酶活力的影响

底物浓度对滇橄榄PPO 酶活力的影响如图5所示。

图5 底物浓度对PPO 酶活力的影响Fig.5 Effect of substrate concentration on PPO enzyme activity

由图5 可知，随着底物浓度的增加PPO酶活力缓慢增大，直到底物浓度达到0.150 mol/L 后酶活力明显增大，在底物浓度0.200 mol/L 时酶活力出现最大值，为6.437 U/（g·min），之后酶活力随底物浓度的增大而减小。原因可能是底物浓度低，酶与底物结合不充分，随着底物浓度增加，酶与底物结合得越来越多，表现为酶活力增强，但当底物浓度达到饱和后产生了抑制作用，继续提高底物浓度对PPO 酶活力影响不大[19]。

2.1.6 反应温度对滇橄榄PPO 酶活力的影响

反应温度对滇橄榄PPO 酶活力的影响如图6所示。

图6 反应温度对PPO 酶活力的影响Fig.6 Effect of reaction temperature on PPO enzyme activity

由图6 可知，随着反应温度的升高，PPO 酶活力明显增加，当反应温度为80 ℃时PPO 酶活力达到11.687 U/（g·min），为最大值。超过80 ℃以后，酶活力随反应温度的升高而减小。这是因为反应温度上升，PPO 分子与邻苯二酚的碰撞几率增加，其活性增大。但PPO 实质是蛋白质，当超过一定温度以后，PPO 分子空间结构遭到破坏，使蛋白质变性，导致酶活性降低或失活[20]。

2.2 滇橄榄PPO 提取工艺的响应面试验结果

2.2.1 回归模型建立

在单因素试验的基础上，对滇橄榄PPO 酶活力影响最大的3 个因素（磷酸盐缓冲液pH 值、液料比、浸提时间）进行三因素三水平的响应面试验设计。根据表1 进行Box-Benhnken 中心组合试验设计，共17 个试验点，响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面设计及结果Table 2 Response surface design and results

对表2 中数据进行回归分析，得到回归方程：滇橄榄PPO 酶活力=23.50+0.40A+2.79B+0.11C+0.72AB+0.88AC+0.054BC-3.68A2-1.31B2-1.57C2。

2.2.2 回归模型方差分析

方差分析结果如表3所示。

表3 回归模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

续表3 回归模型方差分析Continue table 3 Regression model analysis of variance

通过表3 可以看出，F=16.66，P=0.000 6<0.01，此模型具有极显著性，失拟项P=0.987 3>0.05，失拟项不显著，说明该模型对响应值拟合良好。通过表中F值的大小可以得出各因素对滇橄榄PPO 酶活力影响的大小为B（液料比）>A（磷酸盐缓冲液pH 值）>C（浸提时间）。

2.2.3 响应面优化与分析

以PPO 酶活力的回归方程为依据，得到滇橄榄PPO酶活力的响应面图见图7。

图7 各因素间的交互作用Fig.7 Interaction between factors

由图7 可以看出，磷酸盐缓冲液pH 值、液料比和浸提时间3 个因素之间的响应曲面均为凸面且曲面较为陡峭，说明这3 个因素之间的交互作用对滇橄榄PPO 酶活力的影响较大。其中，浸提时间与磷酸盐缓冲液pH 值的响应面坡度最为陡峭，其等高线形成椭圆，表明二者的交互作用对滇橄榄PPO 酶活力的影响最显著。

2.2.4 提取参数优化与验证试验

根据响应面分析软件可以得出滇橄榄PPO 提取的最佳工艺条件参数为磷酸盐缓冲液pH7.92、浸提时间1.51 h、液料比4.0 ∶1（mL/g）。在此工艺参数条件下，模型预测滇橄榄PPO 酶活力为25.07 U/（g·min）。结合试验实际情况，将上述所得的工艺参数修正为磷酸盐缓冲液pH7.9、浸提时间1.5 h、液料比4.0 ∶1（mL/g），重复3 次试验，得到的PPO 酶活力为24.83 U/（g·min），相对误差为0.96%。说明该回归方程能够真实的反映3 个因素对滇橄榄PPO 酶活力的影响，通过该方法得到的最佳提取工艺参数有一定的可靠性，具有实用价值。

2.3 滇橄榄PPO 抑制剂筛选试验结果

2.3.1 抑制剂种类对滇橄榄PPO 酶活力的影响

抑制剂对滇橄榄PPO 酶活力的影响如图8所示。由图8 可知，7 种抑制剂对滇橄榄PPO 的抑制作用明显。多聚磷酸钠的抑制效果最差，无水亚磷酸钠、氯化钙、EDTA-2Na、D-异抗坏血酸4 种抑制剂次之，且抑制效果差别不大。柠檬酸亚锡二钠的抑制作用最强。柠檬酸亚锡二钠具有强还原性，可促使内源性酚类物质氧化成的邻醌还原[21]，此外，还与其独特的结构式有关，在金定樑[22]的研究中发现它可能存在与铜离子的螯合作用，对PPO 酶活力的抑制有重要作用。

图8 不同抑制剂种类对滇橄榄PPO 酶活力的影响Fig.8 Effect of different inhibitor species on PPO enzyme activity of Dianthus oleraceus

2.3.2 不同抑制剂浓度对滇橄榄PPO 酶活力的影响

根据2.3.1 中的试验结果，对柠檬酸亚锡二钠进行试验，其浓度的变化对滇橄榄PPO 酶活力的影响如图9所示。

图9 抑制剂浓度对PPO 酶活力的影响Fig.9 Effect of inhibitor concentration on PPO enzyme activity

由图9 可知，柠檬酸亚锡二钠浓度明显影响PPO酶活力。随着其浓度增加，PPO 酶活力先降低又升高，其中，浓度为0.2～0.4 g/L 时，酶活力急剧下降，此时，已能明显抑制PPO 酶活力，随后下降趋势变缓趋于饱和，当浓度为0.6 g/L 时酶活力有最小值5 U/（g·min），即该浓度下抑制效果最佳。

2.3.3 抑制温度和抑制时间对滇橄榄PPO 酶活力的影响

抑制温度和抑制时间对滇橄榄PPO 酶活力的影响如图10所示。

图10 抑制温度和抑制时间对PPO 活力的影响Fig.10 Effect of inhibition temperature and inhibition time on PPO activity

由图10 可知，在不同温度下，酶活力均总体呈现出随抑制时间的延长而降低的趋势，抑制时间对滇橄榄中PPO 抑制效果明显，在抑制时间160 min 以后PPO 酶活力几乎为零，说明抑制时间超过160 min 在不同温度下都能达到较好的抑制效果。在相同作用时间下，50 ℃条件下对PPO 酶活力的抑制在抑制时间120 min 时，酶活力已达到较低水平，低于其他温度下的酶活力，但酶完全失活的抑制时间也是160 min，说明温度在该条件下对滇橄榄PPO 的抑制作用不显著。因此，在适宜浓度柠檬酸亚锡二钠对滇橄榄PPO 的抑制中，只需控制其抑制时间在160 min 及以上即可，一般情况下，为试验操作方便可直接采用室温进行操作。

3 结论

在滇橄榄PPO 提取工艺优化的试验中，以邻二苯酚为底物，研究了磷酸盐缓冲液pH 值、液料比、浸提时间、反应时间、底物浓度以及反应温度对滇橄榄PPO提取的影响。通过单因素试验分析了各因素对PPO 酶活力的影响，并选取影响最大的3 个因素（磷酸盐缓冲液pH 值、液料比、浸提时间）进行响应面优化试验，结果表明，对滇橄榄PPO 酶活力影响的大小：液料比>磷酸盐缓冲液pH 值>浸提时间，且浸提时间与磷酸盐缓冲液pH 值的交互作用对酶活力影响最为显著。由此得出滇橄榄PPO 提取的最佳工艺条件参数为磷酸盐缓冲液pH7.9、浸提时间1.5 h、液料比4.0 ∶1（mL/g），在此条件下，模型预测滇橄榄PPO 酶活力为24.83 U/（g·min）。经验证该数据有较强的准确性。

在对滇橄榄PPO 抑制剂的筛选中，7 种抑制剂对滇橄榄PPO 都有一定的抑制作用，抑制效果大小顺序为柠檬酸亚锡二钠>明矾>D-异抗坏血酸>无水亚磷酸钠>氯化钙>EDTA-2Na>多聚磷酸钠。继续考察抑制剂浓度、抑制时间和抑制温度对抑制效果的影响后表明，柠檬酸亚锡二钠是最合适滇橄榄PPO 的抑制剂，在抑制浓度为0.6 g/L、抑制时间在160 min 及以上时抑制效果最佳。