羧胺三唑对白细胞介素-1β介导自身炎症性疾病的治疗作用*

段梦园,沈敏,和仪,叶菜英,朱蕾

[1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院药理系,北京 100005;2.中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院风湿免疫科,国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心(NCRC-DID),疑难重症及罕见病国家重点实验室,风湿免疫病学教育部重点实验室,北京 100730]

自身炎症性疾病(autoinflammatory diseases,AIDs)是近年被逐渐认识的一组罕见风湿免疫病,主要是由于编码炎症通路关键分子的基因突变引起固有免疫失调,最终导致机体出现系统性或器官炎症反应。其主要特征为反复或持续炎症(急性期反应物升高),较常见的临床表现包括发热、皮疹、浆膜炎、淋巴结肿大和关节炎等[1-3]。与自身免疫性疾病不同,AIDs缺乏适应性免疫系统的主要致病作用(自身反应性T细胞或自身抗体产生)[1]。据关键性致病细胞因子和失调炎症通路,可将AIDs分为白细胞介素(interleukin,IL)-1β介导疾病、干扰素介导自身炎症综合征、肉芽肿性疾病、补体疾病和其他类[1-2]。

IL-1β介导AIDs是最早被认识的一类AIDs,包括家族性地中海热(familial Mediterranean fever,FMF)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)受体相关周期性综合征(TNF receptor-associated periodic syndrome,TRAPS)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白12(NLRP12)相关自身炎症性疾病(NLRP12-associated autoinflammatory disease,NLRP12-AID)和甲羟戊酸激酶缺乏症(mevalonate kinase deficiency,MKD)等[1-2]。以往秋水仙碱和糖皮质激素是治疗IL-1β介导AIDs的常用药物,但这两类药物并非特异性治疗,部分患者无效,且长期使用不良反应较多。随着炎症小体调控IL-1β作用的揭示,对IL-1β介导AIDs发病机制和治疗药物的研究起到极大促进作用,生物制剂(包括IL-1抑制剂、TNF-α抑制剂以及IL-6抑制剂)显示出良好的应用前景,但其价格昂贵,长期使用有诱发感染和肿瘤的风险,且IL-1抑制剂尚未在国内上市[4-5]。因此,迫切期望开发出对于AIDs有效的新型治疗药物。

羧胺三唑(carboxyamidotriazole,CAI)是一种非细胞毒类抗肿瘤药物,近年研究发现其具有良好抗炎作用,可抑制多种模型的急、慢性炎症[6-10]。尤其是在类风湿关节炎动物模型以及结肠炎动物模型中,CAI能够降低炎症小体活化,减少细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的产生[9-10]。鉴于临床对IL-1β介导AIDs的治疗需求,本研究观察CAI对NLRP12-AID、FMF、TRAPS等3种IL-1β介导AIDs患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)产生促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影响,初步评价CAI治疗IL-1β介导AIDs的可行性。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2018年1—7月在北京协和医院风湿免疫科确诊的3例NLRP12-AID患者、2例FMF患者以及1例TRAPS患者。临床资料见表1。患者无伴发其他AIDs、自身免疫性疾病或其他系统疾病。本研究经中国医学科学院基础医学研究所伦理审查委员会批准(002-2018),患者均签署知情同意书。

表1 3种IL-1β介导的自身炎症性疾病患者临床资料

1.2药物与试剂 CAI由中国医学科学院药物研究所合成,纯度>99.9 %,用二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配置成40 mmol·L-1贮存液,保存于-20 ℃冰箱,临用前用DMEM(高糖)培养基稀释至所需浓度。淋巴细胞分离液(德国GE Healthcare公司,货号:17-1140-02);DMSO(美国Amresco公司,货号:0231);胎牛血清(澳大利亚Gibco公司,货号:10270-106);DMEM(高糖)培养基和双抗(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心);人IL-1β、IL-6和TNF-α酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒[依科赛生物科技(太仓)有限公司]。

1.3仪器 低温高速离心机(湖南可成设备有限公司),Biofuge Stratos高速冷冻离心机(德国Heraeus公司),Synergy H1酶标仪(美国BioTek公司)。

1.4方法

1.4.1PBMCs分离和培养 AIDs患者外周静脉血采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心,获到PBMCs。然后用含10%胎牛血清和0.5%双抗的DMEM(高糖)培养基在37 ℃、5% 二氧化碳(CO2)恒温培养箱中培养细胞。

1.4.2PBMCs给药和指标检测 实验分组:NLRP12-AID患者和FMF患者PBMCs分为空白对照组和CAI各处理组(终浓度分别为10,20和40 μmol·L-1);TRAPS患者PBMCs分为空白对照组和CAI处理组(终浓度为40 μmol·L-1)。细胞培养22 h。

1.4.3细胞上清细胞因子 收集培养22 h后的上清液,采用ELISA法检测上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量,具体按试剂盒说明书操作。用酶标仪在450 nm 波长处读取各孔吸光度(A)值,并按标准曲线换算成相应浓度值。

2 结果

2.1CAI对NLRP12-AID患者PBMCs分泌细胞因子的影响 与空白对照组比较,CAI(10、20和40 μmol·L-1)明显降低NLRP12-AID患者PBMCs分泌IL-1β的水平(P<0.05或P<0.01)。CAI 3个浓度对IL-6和TNF-α的分泌水平有降低趋势,但差异无统计学意义。见图1。

①与空白对照组比较,t=1.852,P<0.05;②与空白对照组比较,t=8.242,8.739,P<0.01。

2.2CAI对FMF患者PBMCs分泌细胞因子的影响 鉴于2例FMF患者在基础水平(未作处理的空白对照组)的细胞因子分泌水平差距较大,因此对2例患者分别进行统计学分析。结果见图2。40 μmol·L-1CAI降低FMF患者ⅠPBMCs分泌IL-1β、IL-6和TNF-α水平(P<0.05或P<0.01),10和20 μmol·L-1CAI亦降低IL-6水平(P<0.01);3个浓度CAI均可降低FMF患者ⅡPBMCs分泌IL-1β水平(P<0.01),40 μmol·L-1CAI亦降低TNF-α的分泌水平(P<0.05),CAI对IL-6的分泌水平有所降低,但差异无统计学意义。

①与空白对照组比较,t=2.654～4.831,P<0.05;②与空白对照组比较,t=2.469～10.940,P<0.01。

2.3CAI对TRAPS患者PBMCs分泌促炎细胞因子的影响 CAI(40 μmol·L-1)降低患者PBMCs分泌IL-1β水平(P<0.05),对IL-6水平有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),见图3。

①与空白对照组比较,t=5.299,P<0.05。

3 讨论

IL-1β介导AIDs之前被称为周期性发热综合征,以周期性发作性发热伴局部炎症为主要特征。基因检测和分子生物学技术的进步揭示炎症小体活化导致IL-1β产生增多是此类疾病的核心发病机制[1-5]。炎症小体是一类细胞内多蛋白复合物,由NOD样受体(Nod-like receptor,NLR)、衔接蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)和效应分子caspase-1组成,激活后可将IL-1β前体(pro-IL-1β)、pro-IL-18切割为成熟形式以及诱导细胞焦亡。炎症小体信号通路相关基因突变后可导致其过度激活,产生过量IL-1β,引起相关AIDs[11]。

NLRP12-AID又称家族性寒冷性自身炎症综合征2(familial cold autoinflammatory disease 2,FCAS2),是一种常染色体显性遗传性AID,主要临床症状包括反复发热、皮疹、关节痛、关节炎和肌痛等[3,12]。

NLRP12-AID的致病基因是NLRP12,其编码蛋白NLRP12是形成炎症小体的NLR家族成员之一。NLRP12基因突变不仅通过持续激活炎症小体进一步活化caspase-1,促进pro-IL-1β的剪切和成熟,还可减弱NLRP12对NF-κB信号通路的负向调节作用,从而导致以IL-1β为主的大量促炎细胞因子的分泌[12]。研究证实,NLRP12-AID患者PBMCs分泌IL-1β和IL-6的水平分别是健康对照PBMCs的80～175倍和43～110倍[13]。因此在临床治疗上,IL-1β的靶向治疗效果良好,可迅速改善患者症状[12,14-15]。本研究显示,CAI(10、20和40 μmol·L-1)可以剂量依赖性降低NLRP12-AID患者PBMCs分泌IL-1β的水平,且对IL-6和TNF-α的分泌水平有降低趋势,故提示CAI可能对NLRP12-AID具有治疗作用。

FMF是世界范围内最常见的AID[3],笔者在前期研究中发现FMF亦是中国人群中常见的AID[16],典型临床表现包括反复发作的发热、浆膜炎导致胸腹痛、关节肿痛等,由血清淀粉样蛋白A引起的系统性AA淀粉样变是主要的并发症[1,16]。FMF是一种与MEFV基因突变有关的常染色体隐性遗传性疾病,MEFV基因编码的炎素蛋白竞争性结合ASC,从而减少NLRP3与ASC分子结合,抑制NLRP3炎症小体的形成。由于MEFV基因突变会引起炎素蛋白数量减少或功能改变,导致NLRP3炎症小体过度激活,从而产生炎症反应[2]。秋水仙碱是FMF的最主要治疗方法,可阻止60%患者发作,但长期使用会产生较多不良反应,尤其对儿童患者的生长发育可产生较大不良影响。IL-1抑制剂在秋水仙碱抵抗的患者中显示出良好疗效,卡纳单抗(一种IL-1抑制剂)已被美国食品药品管理局(FDA)批准用于FMF治疗[4,17]。亦有使用TNF-α抑制剂和IL-6抑制剂有效的报道[4]。IL-6抑制剂还可成功治疗继发于FMF的淀粉样变患者[4,18]。本研究发现,给予CAI处理 对2例FMF患者PBMCs分泌IL-1β、IL-6和TNF-α水平有不同程度的降低作用,提示CAI可能对FMF具有治疗作用。

TRAPS是一种常染色体显性遗传AID,临床表现为反复发热、皮疹、腹痛、肌痛、关节痛/炎、眶周水肿和结膜炎等[1,3]。TRAPS发病与编码Ⅰ型TNF受体(TNF receptor type Ⅰ,TNFR1)的TNFRSF1A基因突变相关。TNFR1可从细胞膜脱落成为游离态,结合TNF-α从而抑制其活性;TNFRSF1A基因突变导致TNFR1错误折叠从而脱落减少,与TNF-α的结合变少,更多的TNF-α与细胞表面受体结合,进而活化下游NF-κB通路,产生大量细胞因子[2]。秋水仙碱对于预防 TRAPS反复发生无效;糖皮质激素短期应用可有效终止发作,但长时间使用可能出现耐药并产生不良反应。依那西普(TNF-α受体-抗体融合蛋白)对部分TRAPS患者有效,但有效性随时间逐渐降低。不推荐使用抗 TNF 单克隆抗体(如英夫利昔单抗和阿达木单抗)治疗,因其可能使部分患者症状加重。此外,亦有 IL-6抑制剂成功应用的报道[4]。研究显示,细胞内积聚的错误折叠TNFR1可引起活性氧产生和抑制自噬,从而激活NLRP3炎症小体[5,19],IL-1抑制剂对于控制TRAPS的临床症状具有良好和持久的作用,这亦支持该研究结果。卡纳单抗被美国FDA批准用于TRAPS治疗,然而,卡纳单抗组患者出现不良事件和严重不良事件的数量明显高于安慰剂组[4,17]。本研究发现,CAI对TRAPS患者PBMCs分泌的较高IL-1β有明显降低作用,因此提示CAI可能对TRAPS具有治疗作用。

综上所述,本研究显示CAI对NLRP12-AID、FMF和TRAPS等3种IL-1β介导AIDs患者PBMCs分泌IL-1β水平均具有显著抑制作用,对IL-6和TNF-α的分泌亦具有不同程度的降低。后续将尝试建立此3种AIDs的细胞模型或动物模型,进一步明确CAI的疗效。笔者近期揭示了炎症小体活化在另一种AID——成人斯蒂尔病(adult-onset Still's disease,AOSD)中的致病机制,CAI通过抑制炎症小体从而发挥对AOSD 的治疗作用[20]。鉴于CAI在多项抗肿瘤临床试验中显示较轻的不良反应和较好的耐受性[9],因此其具有应用于IL-1β介导AIDs治疗的巨大潜力。CAI亦能够降低佐剂性关节炎大鼠滑膜组织中以及三硝基苯磺酸诱导的结肠炎大鼠结肠组织中炎症小体的活化[9-10],这可能是其治疗IL-1β介导AIDs的潜在机制,尚需进一步探究。此外,AIDs属罕见病,本研究纳入的患者样本数量有限,且患者间存在个体差异,每例患者携带的基因突变型不同,病情轻重程度不同。后续研究中将扩大病例数以及纳入其他IL-1β介导AIDs患者样本,并从CAI抑制炎症小体途径深入研究其治疗机制,这将为IL-1β介导AIDs的治疗提供新的途径。