竹叶花椒提取物抑制大鼠肝细胞BRL 3A自噬而诱导ROS累积*

黄艳,蒋佳洛,杨南楠,郭家富,张建,饶朝龙

(成都中医药大学1.公共卫生学院;2.公共卫生学院药食同用中药效用与安全研究中心;3.药学院,成都 611137)

近年来,国内外有关药食同源中药引起肝损伤的报道大量增加,其中包括栀子、薄荷和肉桂等[1]。竹叶花椒是芸香科花椒属植物竹叶花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)(简称:ZADC)夏末秋初采收近成熟尚绿的成熟果实,与花椒属于同一亚属[2]。ZADC也是四川特色药食同源资源,现代研究指出其具有抗氧化、抗菌和抗炎等药理作用,因此常用于解热、解毒、开胃、治疗牙痛和消化不良[3-4]。《中华本草》《四川常用中草药》等记载ZADC有小毒,现代研究发现ZADC可抑制植物和动物的存活率[5]。有研究指出ZADC能引起大鼠肝细胞BRL 3A细胞周期阻滞以及DNA损伤[6]。但ZADC引起肝毒性的潜在作用机制尚未完全阐明。因此,阐明ZADC引起的肝毒性机制将促进ZADC应用的安全性,有助于完善ZADC毒性研究。在自噬过程中,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target rapamycin,mTOR)是自噬的重要调节分子,是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,活化的mTOR可抑制自噬[7]。Unc-51样激酶1(UNC-51-like Kinase 1,ULK1)作为调控自噬的多重信号聚焦点,在营养不足情况下被激活的腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated kinase,AMPK)直接磷酸化ULK1Ser317和ULK1Ser777激活自噬,相反,mTOR磷酸化ULK1Ser757从而抑制自噬,破坏ULK1和AMPK之间的相互作用[8]。研究显示,自噬紊乱可引起细胞内脂质累积、肝细胞凋亡以及肝细胞功能障碍[9]。另有研究显示,自噬功能失调将引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)的过度累积,如自噬缺乏所诱导的氧化应激水平上调可引起肝细胞损伤[10]。正常大鼠肝细胞BRL 3A细胞是大鼠肝脏间质细胞,来源于大鼠的肝脏,其保留了肝细胞许多生物学特性。因此,本研究采用BRL 3A细胞,旨在探索竹叶花椒甲醇提取物引起肝细胞损伤的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药材 竹叶花椒果实采摘于幺麻子食品有限公司四川眉山种植基地,由成都中医药大学药学院高继海副教授鉴定为竹叶花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)的果实。

1.1.2细胞 BRL 3A细胞(Procell CL-0036)由武汉普诺赛生命科技有限公司提供,在本实验室进行培养。

1.1.3主要实验材料 BRL 3A细胞专用培养基、MEM培养基(武汉普诺赛,批号:CM-0036、PM150467),胎牛血清(美国Gibco,批号:26010074),0.25% 胰蛋白酶、二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(北京索莱宝,批号:P1260-1,D8371-250),Anti-beta Actin Rabbit pAb、HRP标记的山羊抗兔IgG、FITC标记的山羊抗兔IgG(武汉赛维尔生物科技有限公司,批号GB11001、GB23303、GB22303),活性氧水平检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:E004-1-1),CCK-8试剂盒(Biosharp,批号:BS350B),RIPA裂解液(上海雅酶生物医药科技有限公司,批号:P0013B),p-mTOR、mTOR、ULK1、Beclin-1、LC3B(Cell Signaling Technology,批号:5536S、2983S、8054S、3495S、43566S),p-ULK1(Affinity,批号:AB2844452),二甲双胍、3-甲基腺嘌呤(3-MA)(MedChemExpress,批号:HY-B0627、HY-19312),其他所用试剂均为分析纯。细胞培养箱(德国美墨尔特),全波长酶标仪(美国BioTek),Facsverse型流式细胞仪(美国BD公司),DYY-6D型电泳仪(北京六一科技有限公司),FV1200型激光共聚焦(奥林巴斯)。

1.2竹叶花椒甲醇提取物(ZADCM)的制备 参照文献[6]提取方法。将竹叶花椒干果0.5 kg加入甲醇溶液2.5 L中,密封浸泡24 h,利用滤纸抽滤、40 ℃下旋转蒸发,于40 ℃下烘干除尽甲醇后恒重收集浸膏,保存于-20 ℃供进一步使用,总提取率约为10.5%。药物处理时,将浸膏溶解在DMSO中,确保DMSO最大浓度<1‰。

1.3细胞的培养与药物处理 BRL 3A细胞系是来自大鼠肝组织的贴壁细胞。细胞培养在含胎牛血清(10%)和青霉素-链霉素溶液(1%)的BRL 3A细胞特异性培养基中,在37 ℃,含5%二氧化碳(CO2)的环境中培养。将BRL 3A细胞与ZADCM(70 μg·mL-1)处理3、6、12、24 h或不同浓度的ZADCM(30、50、70 μg·mL-1)孵育24 h[7],同时给予或不给予3-MA(10 mmol·L-1)或二甲双胍(2.5 mmol·L-1)预处理1 h。

1.4CCK-8法检测BRL 3A细胞存活率 将密度为每孔6×103个的细胞接种于96孔板,用30、50和70 μg·mL-1ZADCM处理24 h[6]。同时,以1‰ DMSO为溶剂对照。加入CCK-8试剂(10 μL),孵育3 h后在450 nm波长下检测吸光度(A值)。

1.5BRL 3A细胞内ROS累积的检测 采用DCFH-DA染色BRL 3A细胞,用激光共聚焦和流式细胞仪检测ROS水平变化。将细胞密度为每皿15×104个细胞接种到规格为15 mm培养皿中,ZADCM处理24 h后,以磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saling,PBS)轻晃清洗细胞表面1～3次,避光孵育DCFH-DA探针30 min,再次利用PBS进行清洗,去除未进入细胞内部的DCFH-DA探针,在激光共聚焦显微镜下观察,拍摄照片。将密度为每孔35×104个的细胞接种于6孔板中,用ZADCM处理后,用10 μmol·L-1DCFH-DA处理30 min。PBS洗涤3次后,胰酶消化收集细胞。流式细胞术检测细胞内ROS水平。

1.6免疫荧光检测自噬标志性蛋白表达 将细胞密度为每皿15×104个的细胞接种到规格为15 mm培养皿中,用ZADCM处理24 h后,4%甲醛固定30 min,PBS洗涤3次,用0.2% TritonX-100渗透。然后以5% BSA作为阻断缓冲液,与一抗在4 ℃下孵育过夜。用PBS洗涤细胞1或2次,并与FITC标记的山羊抗兔IgG在黑暗中孵育30 min。采用Hoechst 33342染料染细胞核15～20 min,在激光共聚焦显微镜下观察,摄像。

1.7Western blotting检测相关蛋白表达 用RIPA裂解液在低温条件下从细胞中提取总蛋白,测定总蛋白浓度。同样数量的蛋白样品在SDS-PAGE凝胶中电泳(浓缩胶浓度为10%,分离胶浓度为10%或12%),转移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1～2 h后,在4 ℃冰箱中孵育一抗(稀释比例均为1：1 000)过夜。用TBST洗涤3次,加入二抗(稀释比例1：5 000),室温孵育1 h。TBST洗涤3次后,用增强化学发光(enhanced chemilu-minescence,ECL)显影液检测蛋白水平,并归一化至相应的β-actin灰度值。

1.8统计学方法 采用SPSS 19.0版Windows软件包进行统计分析,GraphPad Prism 7.0版软件作图。多组均值比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间两两比较采用LSD检验或Dunnett检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1ZADCM抑制BRL 3A细胞自噬 生理状态下,基础水平的自噬可维持细胞稳态,而不足或过量的自噬可能破坏细胞稳态而促进细胞死亡[11]。本课题组前期研究已发现,ZADCM可引起BRL 3A细胞存活率降低,因此,推测ZADCM诱导的BRL 3A细胞损伤可能与自噬有关。由于自噬是一个动态的变化过程,因此采用BRL 3A细胞在ZADCM(70 μg·mL-1)的处理下作用不同时间(3、6、12、24 h),结果显示,ZADCM处理24 h后,抑制BRL 3A细胞中LC3B和Beclin-1蛋白的表达水平(图1)。进一步,免疫荧光技术测量了BRL 3A细胞中的自噬标志性蛋白LC3B。结果显示,与对照组比较,BRL 3A细胞中LC3B蛋白的荧光强度明显降低并呈剂量依赖性(图2)。

①与对照组比较,F=15.150,P<0.05;②与对照组比较,F=409.938,P<0.01。

①与对照组比较,F=37.482～62.258,P<0.05;②与对照组比较,F=11.024,5.731,P<0.01。

2.2ZADCM通过激活mTOR/ULK1信号通路抑制BRL 3A细胞自噬 为了探明ZADCM抑制细胞自噬活性的分子机制,本研究检测了mTOR/ULK1信号通路。通过Western blotting检测发现,在ZADCM处理BRL 3A细胞不同时间点后,ZADCM处理12和24 h后的mTORSer2448、ULK1Ser757的磷酸化水平升高(图3),结果提示ZADCM诱导的细胞自噬抑制可能与激活mTOR/ULK1信号通路有关。

①与对照组比较,F=7.870～21.443,P<0.05。

2.3ZADCM诱导BRL 3A细胞中ROS累积 氧化应激引起的肝细胞损伤可能是中药引起肝脏疾病的共同病理生理基础,因此本研究用不同浓度的ZADCM处理细胞24 h,对照组和30、50、70 mg·mL-1组的ROS荧光强度分别是(142.33±7.51),(163.67±3.37),(235.33±2.56),(370.33±2.71);与对照组比较,差异有统计学意义(F=9.438,P<0.05;F=172.22,4 078.62,F=0.01)。

结果显示,ZADCM诱导BRL 3A细胞中ROS的产生并呈剂量依赖性(图4)。

图4 ZADCM对BRL 3A细胞内ROS水平的影响

2.4二甲双胍和3-MA对BRL 3A细胞自噬与ROS累积的影响 氧化应激与自噬互相调控,因此,推测ZADCM诱导的BRL 3A细胞中ROS累积可能与自噬抑制有关。为验证这一假设,二甲双胍预处理BRL 3A细胞1 h后,ZADCM诱导的自噬相关蛋白LC3B和Beclin-1的抑制被逆转(图5)。采用3-MA预处理1 h后,LC3B和Beclin-1蛋白的抑制更加明显。与ZADCM组比较,二甲双胍组细胞内ROS生成量减少,细胞活力升高。而3-MA组的细胞内ROS生成量增加,细胞活力降低(图6)。以上结果显示,ZADCM可能通过诱导自噬抑制引起ROS累积,从而引起BRL 3A细胞活力下降。

①与对照组比较,F=59.504～78.525,P<0.01;②与ZADCM组比较,F=15.480,P<0.01;③与ZADCM组比较,F=2.991～5.215,P<0.05;④与对照组比较,F=64.178,P<0.05。

①与对照组比较,F=391.712～1017.125,P<0.01;②与ZADCM组比较,F=5.167,4.684,P<0.05;③与ZADCM组比较,F=51.317,83.603,P<0.01。

3 讨论

肝毒性是中药引起严重的药物不良反应之一,近年有关中药引起肝毒性的临床病例和实验研究发现,多数中药未经过上市前的毒性测试,已造成不同程度的肝损伤。例如,决明子和白果等中药可通过氧化应激和炎症反应等途径引起大鼠肝功能紊乱和肝细胞毒性[1]。因此,中药的肝毒性值得探究。

竹叶花椒,味辛、微苦,有小毒,研究已报道ZADCM含有生物碱、脂肪酸和萜类化合物等[6]。研究发现,吡咯里西啶类生物碱(PAs)可诱发肝窦阻塞综合征,长期暴露于PAs,可引起肝纤维化和胆管上皮增生[12]。此外,过量的脂肪酸可抑制肝细胞活性并诱导肝细胞凋亡[13]。因此,ZADCM诱导的BRL 3A细胞损伤可能与ZADCM中的生物碱和脂肪酸类物质有关。

肝细胞损伤是诸多肝病长期存在的共同病理表现,自噬是肝细胞损伤中的一种主要机制[9]。本研究发现ZADCM处理BRL 3A细胞后,细胞中自噬相关蛋白水平降低,免疫荧光结果显示LC3B荧光强度也逐渐降低。这些结果均提示ZADCM的细胞毒性与其抑制BRL 3A细胞自噬密切相关。此外,自噬的调控机制涉及不同分子和信号通路,本研究发现,ZADCM处理12或24 h后,mTORSer2448和ULK1Ser757的磷酸化水平显著升高。这一结果提示ZADCM诱导的大鼠肝细胞自噬抑制可能与mTOR/ULK1信号通路的激活有关。

过量ROS的生成已成为肝损伤发生机制中的重要环节。因此,本研究通过流式细胞仪和激光共聚焦观察ZADCM对肝细胞ROS水平的影响。结果发现,ZADCM可诱导细胞内ROS累积,这一结果与JIANG等[6]结果一致。研究发现,氧化应激与自噬相互调控,自噬可能通过吞噬和降解氧化物质清除ROS,减少氧化损伤[14]。基于以上结果,对BRL 3A细胞抑制性自噬与ROS累积之间的联系进行探究。采用二甲双胍或3-MA预处理后,细胞内ROS水平降低或增加,细胞活力升高或降低。结果提示ZADCM诱导的大鼠肝细胞ROS累积可能与自噬抑制有关。

综上所述,ZADCM可通过诱导肝细胞自噬抑制从而诱导ROS累积,引起大鼠肝细胞损伤。虽然ZADCM诱导肝损伤的作用机制已有初步研究,但其仍是一种混合物,并且只对药物作用细胞24 h后进行了探究。因此,在进一步的研究中,应探索其诱导肝损伤的具体毒性物质基础以及其他药物作用时间点进行研究,为ZADC诱导的细胞毒性的预防提供新的见解以及为ZADC的应用提供基础科学证据。