新疆毛菊苣乙酸乙酯萃取物对小鼠降糖作用的研究*

苏林洁,邹楠,赫翠,陈卫军,秦冬梅,蔡钢

(1.石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室,石河子 832000;2.石河子大学第一附属医院,石河子 832000;3.新疆第二医学院中医学院,克拉玛依 834000)

糖尿病是全球性较为普遍的慢性疾病之一。我国糖尿病的发病率约为10%[1],主要特征是高血糖,机体若处于长期的高血糖状态将导致机体生化代谢及防御功能紊乱[2],因此延缓糖尿病的进一步发展是关键,但目前临床上尚无彻底根治糖尿病的方法及药物,所以寻找一种高效、安全的降糖药物对治疗糖尿病具有重要意义。

传统中药材毛菊苣(CichoriumglandulosumBoiss.et Huet)是新疆维吾尔族习用药材[3],药理学研究表明,毛菊苣具有降血糖[4]、降血脂[5]、降尿酸[6]、保肝[7]及调节肠道菌群[8]等药理作用。目前对毛菊苣降血糖的有效部位未进行系统和深入的探索,本课题组前期对维吾尔药材毛菊苣进行深入研究,发现毛菊苣乙酸乙酯萃取部位(ethyl acetate extract ofCichoriumglandulosum,CEE)的主要有效成分为倍半萜类化学成分[9],该成分具有较强的生物活性作用,并且含量最高,其中山莴苣苦素是一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的天然化合物,此类酶可直接参与淀粉与糖原的代谢途径。因此本课题组预测CEE可能具有降血糖的作用。本实验采用四氧嘧啶诱导小鼠糖尿病的模型[10],给予CEE进行干预,观察其对糖尿病造模小鼠糖耐量和胰岛素耐量的影响、血糖调节情况等,探究其降血糖可能的机制,从而研究CEE的降血糖作用。

1 材料与方法

1.1动物 无特定病原体(SPF)级昆明种小鼠70只,6周龄,体质量20～25 g,购自新疆医科大学动物实验中心,实验动物生产许可证号:SCXK(新)2020-0003。小鼠于室温(23±2) ℃,相对湿度约50%,12/12 h光暗交替的条件下进行饲养,自由摄食饮水,在实验前适应性喂养1周,动物实验严格按照石河子大学医学院第一附属医院实验动物管理法规的规定和总则建议进行。

1.2药物与试剂 毛菊苣购自新疆维吾尔自治区和田县,经石河子大学药学院秦冬梅教授鉴定为菊科菊苣属植物毛菊苣(CichoriumglandulosumBoiss.et Huet)的地下根部分,保存于新疆特种植物药重点实验室药剂学研究室。盐酸二甲双胍(北京京丰制药集团,批号:2012020,规格:每片0.5 g);四氧嘧啶(阿拉丁公司,含量≥98.0%,批号:2244-11-3);丙二醛(malondialdehyde,MDA,批号:20211207)、胰岛素(INS,批号:20210220)、一氧化氮(nitric oxide,NO,批号:20200220)、三酰甘油 (triglyceride,TG,批号:20210318)、总胆固醇(total cholesterd,TC,批号:20210318)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C,批号:20210329)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C,批号:20210416)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供;95%乙醇(天津市河东区红岩试剂厂,批号:20201119);乙酸乙酯(天津永晟精细化工有限公司,批号:20200106);0.9%氯化钠溶液(石药银湖制药有限公司,批号:31319010609)。

1.3仪器 5426XG型离心机(德国艾本德股份公司);BP211D型分析天平(德国赛多利斯,感量:0.01 mg);Varioskan LUX型多功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific,USA);VORTEX0型涡旋混匀器(上海达姆实业有限公司);SKY-100B型恒温摇床(上海天呈实验仪器制造有限公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂,型号:RE-2000A);罗康全活力型精密血糖仪(美国罗氏,编号:2423585);冷冻干燥器(上海比朗仪器制造有限公司,型号:LGJ-18A);数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,型号:KQ-500DE)。

1.4药材提取及配制 将毛菊苣根清洗、晾干、粉碎,用95%乙醇浸泡24 h,多次浸泡至浸泡液接近无色,合并浸泡液,三层洁净纱布滤过,抽滤,用旋转蒸发器减压旋蒸浓缩,得到毛菊苣提取物浸膏。将毛菊苣提取物浸膏用纯化水溶解,用乙酸乙酯溶液萃取得萃取液,将萃取液用旋转蒸发器减压旋蒸浓缩,置于冷冻干燥机中真空干燥,得CEE的冻干粉。

1.5小鼠糖尿病模型的建立 取昆明种小鼠70只,适应性喂养1周,随机分组。根据实验要求将70只小鼠分为6组,为排除造模失败和死亡率对实验的影响,除模型对照组20只,其余各组均为10只,随机分为正常对照组、模型对照组、CEE小剂量组(150 g·kg-1)、CEE中剂量组(300 g·kg-1)、CEE大剂量组(600 g·kg-1)和二甲双胍组(300 mg·kg-1)。CEE治疗组剂量是根据临床原生药应用及药材提取率换算得到,并结合前期毛菊苣实验研究结果[11-12],阳性药二甲双胍剂量根据临床给药剂量换算得到。除正常对照组给予0.9%氯化钠溶液外,其余各组腹腔注射造模药物四氧嘧啶[13],剂量为200 mg·kg-1,注射时间限制为5 min,分别于造模第3 天和第7 天同一时间,禁食12 h,取小鼠尾静脉血检测血糖值,血糖≥16 mmol·L-1为造模成功。

1.6动物分组与处理 造模第7 天后,停止造模给药,除正常对照组和模型对照组灌胃给予0.9%氯化钠溶液外,其余各组灌胃给予相应剂量治疗药物,每日给药1次,以5 d为时间间隔测定血糖值,并记录小鼠每日体质量及活动情况变化,持续30 d,利用小鼠体质量变化率计算体质量差异,体质量变化率(%)=(现体质量-原体质量)/原体质量×100%,并分析30 d后体质量较原始体质量差异。

1.7糖耐量实验 在标本采集前1 d进行葡萄糖耐量实验,各组动物禁食不禁水3～4 h,称量小鼠体质量并记录,测定空腹血糖即给葡萄糖前(0 h)血糖值,CEE小、中、大剂量组及二甲双胍组给予对应剂量的药物,模型对照组及正常对照组不处理,30 min后,腹腔注射1.0 g·kg-1葡萄糖,分别于注射后经0、30、60和120 min 尾静脉取血,用血糖测试仪严格按照说明书测其血糖值,并计算葡萄糖耐量曲线下面积(glucose tolerance area under curve,GAUC)。

1.8胰岛素耐量实验 各组小鼠进行胰岛素耐量实验前,需禁食不禁水6 h,预先准备50%葡萄糖溶液,防止小鼠低血糖休克。为避免实验过程中小鼠死亡,预实验确定胰岛素剂量为0.25 U·kg-1,实验时,首先用血糖仪检测各组小鼠尾静脉空腹血糖,然后腹腔注射0.25 U·kg-1胰岛素,分别于15、30、60和90 min用血糖仪监测小鼠的尾静脉血糖浓度,并计算胰岛素耐量曲线下面积(insulin tolerance area under curve,IAUC)。

1.9血清测定 实验第30天,小鼠末次给药后1 h,自小鼠眼眶内眦取血1 mL,室温下静置30 min后,用4 ℃预冷的离心机3 000 r·min-1离心10 min(r=5.2 cm),分离血清。取已分离血清,严格按照相关试剂盒说明书检测血清中INS、MDA、NO、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平。

2 结果

2.1CEE对糖尿病小鼠体质量影响 结果见图1。从生长曲线结果可知,正常对照组小鼠体质量增长最快,模型对照组体质量下降最快。从小鼠30 d平均体质量变化率可知,与正常对照组比较,模型对照组体质量变化率呈负增长,说明小鼠体质量显著性降低(P<0.01),与模型对照组比较,CEE小、中剂量组及二甲双胍组体质量变化率均显著降低,说明药物干预组小鼠体质量缓慢减轻(P<0.01)。

A.正常对照组;B.模型对照组;C.二甲双胍组;D.CEE小剂量组;E.CEE中剂量组;F.CEE大剂量组。①与正常对照组比较,t=20.93,P<0.01;②与模型对照组比较,t=5.219～13.200,P<0.01。

2.2造模期间四氧嘧啶对小鼠血糖水平的影响 结果见表1。造模第3 天及第7天,正常对照组血糖值与其他组之间差异有统计学意义(P<0.01),表明四氧嘧啶对小鼠血糖水平具有显著性影响,模型对照组以及CEE各剂量组之间差异无统计学意义,表明四氧嘧啶对小鼠血糖影响基本稳定。按照造模小鼠总数为70只计算,在造模第3 天时,造模成功率为95.71%,死亡率为4.29%(即造模成功67只,死亡3只);在造模第7 天时,造模成功率为88.57%,死亡率为11.43%(即造模成功62只,死亡8只),在后续给药过程中无小鼠死亡。

表1 造模期间四氧嘧啶对小鼠血糖水平的影响

2.3CEE对糖尿病小鼠血糖水平的影响 每间隔5 d测定糖尿病小鼠血糖值,结果见图2。与正常对照组比较,随着给药时间延长,CEE小、中、大剂量组均表现出对糖尿病小鼠的有效治疗作用;与模型对照组比较,二甲双胍组及CEE各剂量组小鼠血糖水平逐渐降低,其中大剂量CEE具有显著抑制糖尿病小鼠血糖作用(P<0.01)。

2.4CEE对糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影响 各组小鼠血糖值均在糖负荷30 min 时达到峰值,30 min后血糖值随着时间的增加呈下降趋势;与正常对照组比较,模型对照组GAUC显著增大,同时血糖值在120 min时显著性升高(P<0.01),与模型对照组比较,CEE大剂量组及二甲双胍组GAUC显著性降低(P<0.01),两组血糖值在120 min时显著性降低(P<0.01),CEE中剂量组血糖值在120 min时显著性降低(P<0.05),说明CEE能明显降低小鼠血糖值,提高小鼠糖耐量,并且大剂量组效果比中剂量组更佳,见图3。

A.正常对照组;B.模型对照组;C.二甲双胍组;D.CEE小剂量组;E.CEE中剂量组;F.CEE大剂量组。①与正常对照组比较,t=-3.726,-9.347,P<0.01;②与模型对照组比较,t=9.953,12.620,P<0.01;③与模型对照组比较,t=2.906,3.395,P<0.05。

2.5CEE对糖尿病小鼠胰岛素耐量的影响 小鼠的胰岛素耐量在一定时间内呈下降趋势,结果见图4。模型对照组小鼠空腹血糖水平显著高于正常对照组,腹腔注射胰岛素后,0～60 min内模型对照组小鼠血糖水平下降缓慢,在60 min达到血糖最低值,且在60 min后血糖水平后逐渐回升,同时药物干预组在30 min达到血糖最低值,30 min后血糖水平逐渐回升,说明模型对照组小鼠胰岛素耐量明显增加,自身产胰岛素明显不足。与正常对照组比较,模型对照组IAUC显著增大(P<0.01),与模型对照组比较,各药物干预组IAUC均显著性降低(P<0.01或P<0.05),CEE大剂量组及二甲双胍组在90 min时胰岛素耐量显著降低(P<0.05)。

A.正常对照组;B.模型对照组;C.二甲双胍组;D.CEE小剂量组;E.CEE中剂量组;F.CEE大剂量组。①与正常对照组比较,t=-11.391,-14.560,P<0.01;②与模型对照组比较,t=4.990,4.545,P<0.01;③与模型对照组比较,t=3.174～3.888,P<0.05。

2.6CEE对糖尿病模型小鼠血清INS、MDA、NO的影响 结果见图5。结果表明,与正常对照组比较,其他组均差异有统计学意义(均P<0.01)。与模型对照组比较,CEE各剂量组小鼠血清中INS均提高,小鼠血清中MDA和NO水平均降低,且呈剂量依赖性,其中CEE大剂量组差异有统计学意义(P<0.01)。

2.7CEE对糖尿病模型小鼠血脂水平的影响 小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平测定结果见图6。与正常对照组比较,模型对照组小鼠血清TG、TC、LDL-C水平显著升高(均P<0.01),HDL-C水平降低差异无统计学意义;与模型对照组比较,CEE各剂量组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平显著降低(均P<0.01),其中CEE大剂量组作用更显著,二甲双胍组及CEE大剂量组能显著升高血清中HDL-C水平(P<0.01)。

A.正常对照组;B.模型对照组;C.二甲双胍组;D.CEE小剂量组;E.CEE中剂量组;F.CEE大剂量组。①与正常对照组比较,t=-3.012～-2.510,P<0.01;②与模型对照组比较,t=2.027～8.235,P<0.01。

3 讨论

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病,由胰腺的胰岛素分泌不足、或相对不足,或胰岛素作用障碍所致。本研究以四氧嘧啶为造模药物,其中给药途径、剂量和次数等因素均对小鼠造模过程有较大的影响[13];研究选择以200 mg·kg-1的剂量腹腔注射,是较为理想且经济的造模方法,最终造模成功率为88.57%,死亡率为11.43%,各组体质量均呈下降趋势,表明造模药四氧嘧啶对小鼠体质量具有显著影响。二甲双胍为临床治疗2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)的一线推荐药物,近年来已逐渐应用于1型糖尿病(type 1 diatetes,T1DM)的治疗,并取得显著疗效。在我国,二甲双胍已批准用于T1DM治疗。二甲双胍的降糖机制主要是通过抑制糖异生作用降低肝葡萄糖输出。目前在T1DM中主要作为辅助治疗手段,起到减少胰岛素用量、减轻体质量增加的效果,同时具有心血管获益的功能[14],可作为本研究的阳性对照药。

CEE的主要有效成分为毛菊苣倍半萜类化合物[15],其中山莴苣苦素,是碳水化合物水解的关键酶,能从碳水化合物分子链末端依次切开α-1,4糖苷键,缓慢水解α-1,6糖苷键[16-17]。而α-葡萄糖苷酶抑制剂则可抑制α-葡萄糖苷酶活性,降低多糖降解,延缓肠道对碳水化合物的吸收,达到改善高血糖的效果[18],

实验中小鼠血糖检测结果显示,CEE各剂量组均可抑制糖尿病小鼠血糖水平,并呈现一定的剂量依赖性。

糖耐量是临床糖尿病诊断及衡量药效的重要指标,将糖耐量曲线转化为曲线下面积而得到固定的数值,通过对曲线下面积进行数据统计和分析,可以更精确地判断糖尿病患者或实验动物的糖耐量[19]。糖耐量实验结果表明,各组小鼠的血糖值均在糖负荷30 min时达到峰值,120 min时血糖值基本回落,CEE大剂量组GAUC显著性降低,且血糖值在120 min时显著性降低(P<0.01),表明大剂量CEE明显增加小鼠对葡萄糖的利用能力,并且效果与二甲双胍相近。胰岛素耐量实验结果表明,药物干预组在30～60 min达到血糖最低值,60 min后血糖水平逐渐回升,与模型对照组比较,CEE大剂量组在90 min时胰岛素耐量显著降低(P<0.05),说明CEE高剂量可明显增加小鼠对葡萄糖的利用能力,降低糖尿病小鼠的胰岛素耐量。但其作用机制是增加胰岛素敏感性还是降低胰岛素抵抗有待进一步研究。

为进一步明确CEE的降血糖效果及机制,本研究检测小鼠血清中INS、MDA及NO水平,结果显示模型对照组小鼠血清中INS水平显著低于正常对照组,表明模型对照组中胰岛β细胞的分泌功能出现异常,造模成功,且CEE中、大剂量组小鼠血清中INS的水平显著增加,表明CEE可能会促进胰岛β细胞的分泌功能。胰岛β细胞也是体内氧化应激的重要靶点,ROS通过损伤胰岛β细胞,促进β细胞凋亡,还可通过影响INS信号转导通路间接抑制β细胞功能。β细胞一旦受损,INS分泌水平降低、分泌高峰延迟,最终导致体内血糖波动加剧。机体脂质过氧化也会影响糖尿病的发生,MDA可促进脂质过氧化的发生,反映机体脂质过氧化的程度[20]。研究结果显示,CEE能降低MDA含量,表明CEE可明显改善糖尿病小鼠体内的氧化应激反应,改善小鼠的糖尿病病情,增强小鼠抗氧化能力。除此之外,糖尿病的发病机制与体内NO水平也有一定的联系,并且呈负相关[21]。本研究实验结果显示,模型对照组NO水平显著高于正常对照组,而CEE大、中剂量组以及二甲双胍组NO水平均不同程度降低,说明CEE可通过调节NO水平发挥降血糖作用。

糖尿病血脂异常在DM患者中非常普遍,通常与胰岛素抵抗相关[22]。糖尿病小鼠血清TG、TC、LDL-C水平显著升高,HDL-C水平降低,本研究结果发现,给药后,CEE各剂量组小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平下降,其中CEE大剂量组作用更显著,二甲双胍组及CEE大剂量组能显著升高血清中HDL-C水平,因此CEE可通过调节糖尿病小鼠脂质代谢来发挥降糖作用。

综上所述,CEE对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠有显著的降血糖作用,其机制可能是显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性,同时调节糖脂代谢紊乱,增强机体抗氧化能力。CEE作为天然产物,成分复杂,其降血糖的主要有效活性成分及机制仍有待进一步研究。