藏药徳孜阳新醇提物对胃癌细胞SGC-7901迁移的影响※

易 云,江亚惠,杨生玺,拉青才让,2,赵延礼*

(1.青海大学医学部,西宁 810001;2.青海省海南藏族自治州藏医院,共和 813000)

本课题组前期研究发现德孜阳新(DZYX)醇提物具有抑制肿瘤细胞增殖的作用,本研究通过将DZYX醇提物作用于人胃癌细胞SGC-7901来验证其对胃癌细胞迁移的影响,并进一步探究DZYX抗胃癌的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 细胞株

人胃癌细胞株SGC-7901购于武汉普诺赛公司;SGC-7901细胞株来源于胃腺癌患者的淋巴结转移灶,具有高转移、高侵袭性。

1.1.2 主要实验试剂

DZYX由青海省海南州藏医院提供。高糖DMEM培养基和胎牛血清购自美国Corning公司;CCK-8试剂盒(批号C6102030)购自上海翊圣生物科技有限公司;Actin-Tracker Green(微丝绿色荧光探针)试剂盒购自上海碧云天公司;β-actin、p-mTOR、P-AKT 抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;MMP-2抗体购自澳大利亚Affinity公司。

1.1.3 仪器设备

倒置显微镜及Ti2-E型荧光显微镜购自日本Nikon公司;多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司;RTCA DP实时无标记细胞功能分析仪购自美国Agilent公司;PowerPac Universal型电泳仪、Mini PROTEAN Tetra Cell型电泳槽购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DZYX提取与配制

研磨DZYX丸剂,称取60 g DZYX粉末浸泡于95%乙醇中过夜;次日回流提取3次,将提取物过滤后进行旋转蒸发浓缩,干燥得到DZYX醇提物。称取DZYX醇提物6 g溶于10 mL DMSO中配制成浓度为600 mg/mL的DZYX醇提物母液;经0.22 μm滤膜过滤后分装,置-20℃ 冰箱储存。

1.2.2 实验分组

实验设置对照组(含1‰ DMSO)、阳性对照顺铂组(10 μg/mL DDP)和DZYX组。DZYX组采用完全培养基稀释并过滤DZYX醇提物,配制成浓度为200、400、600 μg/mL的液体。

1.2.3 CCK-8实验

以CCK-8法观察不同浓度的DZYX醇提物对SGC-7901细胞增殖的影响:取处于对数生长期的SGC-7901细胞,按照每孔5×103个细胞均匀铺于96孔板中,待细胞完全贴壁后按照分组设计更换为不同浓度的含药培养基,分别培养24、48 h后,每孔加10 μL的CCK-8溶液,避光孵育1 h,用酶标仪测量450 nm处的吸光度值(每组设置6个复孔)。

细胞活力=[OD(加药组)-OD(空白组)]/[OD(对照组)-OD(空白组)]×100%

1.2.4 细胞动态迁移曲线(RTCA)检测

取CIM Plate 16孔板,下室加入165 μL含血清培养基,上室加30 μL无血清培养基,平衡1 h后置于RTCA Station上测基线;收集对数生长期的SGC-7901细胞,用无血清培养基配制细胞浓度为8×105个/mL的悬液;取出板子,每孔按实验分组加入50 μL无血清含药培养基,再加入50 μL细胞悬液,轻轻拍打混匀;在超净台内静置30 min后上机检测RTCA。

1.2.5 Wound healing实验

取SGC-7901细胞铺满六孔板,利用100 μL枪头在细胞培养皿中划出3道竖线,用PBS清洗3次,对照组加入含DMSO的无血清培养基,实验组加入含DZYX醇提物(浓度为400 μg/mL)的无血清培养基继续培养,0、24、48 h时在倒置显微镜下拍照观察。

细胞迁移率=细胞迁移面积/细胞划痕面积。

1.2.6 Transwell实验

收集对数生长期SGC-7901细胞。在Transwell小室内接种无血清的含不同浓度药物的细胞悬液200 μL,细胞密度为1×106个/mL,将Transwell小室放入培养板中,Transwell下室为含10%胎牛血清的DMEM培养基(600 μL),置培养箱继续培养24 h,取出Transwell小室,用PBS洗涤3次,以棉签擦拭小室聚碳酸酯膜表面细胞,用4%多聚甲醛固定10 min、0.1%结晶紫染液染色15 min,用PBS洗涤3次小室至透明,干燥后置显微镜下观察并随机选取3个视野计算迁移细胞个数。

1.2.7 细胞骨架染色

消化收集SGC-7901细胞并将细胞浓度调整为2×104个/mL;于六孔板孔中央滴加20 μL完全培养基,用镊子将盖玻片放入孔中央,使其完全吸附于六孔板;每张玻片上滴加500 μL细胞悬液,置培养箱培养5 h,细胞贴壁后,贴紧侧壁缓慢加入2 mL完全培养基,孵育过夜后更换含药培养基(对照组含1‰ DMSO,实验组含浓度为400 μg/mL的DZYX醇提物),置培养箱培养24 h后弃含药培养基,用PBS洗涤3次,每孔加入1 mL 4%多聚甲醛,于室温固定15 min,用预冷PBS洗涤;每孔加入1 mL TritionX-100,于室温孵育10 min,用含0.1% TritionX-100的PBS洗涤3次,在载玻片上滴加200 μL Actin-Tracker Green稀释液(1:100),于室温孵育30 min;每孔加入200 μL DAPI染液,于室温孵育5 min,用PBS洗涤3次,吸尽盖玻片多余液体,最后滴加抗荧光淬灭剂,置共聚焦显微镜下观察。

1.2.8 SGC-7901细胞中的MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平检测

用浓度为400 μg/mL的DZYX醇提物处理SGC-7901细胞 24 h,裂解提取蛋白质。SDS-PAGE实验完成后,将蛋白样品转移到PVDF膜上,用5%脱脂牛奶于常温封闭1 h。用PBST洗膜3次,孵一抗后置冰箱(4℃)过夜,用PBST洗膜3次后孵二抗,再次用PBST洗膜3次后加发光液显影,用Image J软件分析。以β-Actin为内参,计算MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达水平。

目标蛋白的相对表达量(IOD)=目标蛋白的灰度值/β-Actin灰度值。

1.2.9 转录组学分析

从对照组SGC-7901细胞和用600 μg/mL DZYX醇提物处理24 h的SGC-7901细胞中提取RNA(每组重复3次)。使用分子生物学设备对RNA样品的纯度、浓度和完整性进行检查,以保证样品合格。富集mRNA后,构建cDNA文库,然后在Illumina Novaseq系统上进行批量RNA测序和转录组分析,此过程委托Biomarker Technologies公司(中国北京)进行。采用DESeq2样本进行差异分析,设定︱log2FC︱≥2、FDR<0.01,对6个样品进行差异基因筛选并绘制火山图对结果进行可视化分析。将FPKM作为基因表达水平的衡量标准进行差异性基因表达分析,然后对差异表达基因进行了GO富集分析和KEGG通路富集分析。利用GeneCards数据库收集上皮间质转化(EMT)相关基因,与药物作用后的差异表达基因进行交集分析,同时对药物作用后出现差异表达的主要迁移相关基因进行基因表达量分析,进一步探讨DZYX醇提物对胃癌细胞迁移的抑制作用及机制。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 CCK-8实验

与对照组比较,不同浓度DZYX醇提物分别作用SGC-7901细胞24、48 h可抑制胃癌SGC-7901细胞活性,且呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.01)。(表1)

表1 DZYX 醇提物对SGC-7901细胞活性的影响

2.2 RTCA实验

监测胃癌SGC-7901细胞动态迁移数量发现,在不同浓度DZYX醇提物处理下,胃癌细胞的迁移数量降低,且随DZYX醇提物浓度的增加,迁移的细胞数量明显下降,具有浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.01)。提示DZYX醇提物具有抑制胃癌SGC-7901细胞迁移作用,根据RTCA实验结果,选取浓度为400 μg/mL的DZYX醇提物做后续实验。(图1,表2)

图1 DZYX醇提物对SGC-7901细胞迁移的影响

表2 RTCA实时迁移曲线定量分析结果

2.3 Wound healing实验

Wound healing实验结果显示,相较于对照组,DZYX醇提物作用于胃癌SGC-7901细胞24 h和48 h后,伤口愈合趋势减弱,划痕愈合率降低,差异有统计学意义(P<0.01),表明DZYX醇提物能降低划痕愈合率,抑制胃癌细胞迁移。(图2,表3)

*Yuan Peng is President of China Institutes of Contemporary International Relations.

图2 SGC-7901细胞迁移图(×100)

表3 SGC-7901细胞迁移率

2.4 Transwell实验

为进一步验证DZYX醇提物抑制胃癌细胞迁移的能力,DZYX醇提物作用胃癌SGC-7901细胞24 h后的Transwell实验结果显示,DZYX醇提物作用胃癌SGC-7901细胞穿越Transwell小室的细胞数目远低于正常对照组,细胞迁移率降低,差异有统计学意义(P<0.01)。(图3,表4)

图3 SGC-7901细胞迁移图(×40)

表4 SGC-7901细胞迁移数目

2.5 细胞骨架染色实验

肿瘤细胞的迁移运动离不开细胞骨架,鬼笔环肽荧光染料能与细胞骨架中的F-actin蛋白特异性结合。置激光共聚焦显微镜下观察发现,与对照组相比,经DZYX醇提物处理后,SGC-7901细胞内F-actin聚合纤维丝的数量显著减少,细胞表面的丝状伪足减少甚至消失,细胞骨架断裂成团,表明DZYX醇提物能够抑制微丝的生成,促使细胞骨架断裂,导致胃癌细胞失去黏附收缩能力,从而抑制胃癌SGC-7901细胞的迁移。(图4)

图4 经鬼笔环肽染色的细胞骨架(×400)

2.6 蛋白表达测定实验

与对照组比较,DZYX醇提物能够诱导SGC-7901细胞中的MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平下降,差异均具有统计学意义(P<0.05),提示DZYX醇提物可能通过下调MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平抑制胃癌细胞迁移。(图5,表5)

图5 DZYX对细胞迁移和PI3K/AKT信号通路相关蛋白的影响

表5 p-AKT、p-mTOR及MMP-2蛋白含量

2.7 转录组学分析

通过转录组学分析,并与Control组比较,在经600 μg/mL DZYX醇提物处理24 h的SGC-7901细胞中发现了2 338个差异基因,其中下调基因1 472个、上调基因866个。(图6)

图6 差异表达基因火山图

在GeneCards数据库中检索到与EMT相关的基因4 869个,将其与筛选出的差异基因进行韦恩分析后,2个集合共有交集基因587个,表明DZYX醇提物对EMT过程有一定影响,存在潜在靶点(图7)。

图7 DZYX醇提物与EMT相关基因韦恩图

从差异基因中可直接筛选到部分与迁移相关的MMPs家族基因MMP-1、MMP-11、MMP-13、MMP-24及EMP-1基因,经GEPIA网站验证,上述MMP基因在胃癌中均高表达,基因表达量热图显示DZYX醇提物可直接降低MMP-11、MMP-13、MMP-24的表达并上调EMP-1,提示了其对胃癌细胞迁移的抑制作用。(图8)

图8 迁移相关基因表达量热图

将差异基因经GO功能富集分析发现,在细胞组分上主要影响细胞膜(integral component of membrane membrane)、整合素(integrin complex)及层粘连蛋白(laminin complex laminin-2 complex)等;在生物学过程中主要富集在信号转导、细胞通讯及细胞凋亡调控等过程(图9)。

KEGG信号通路富集分析发现,差异基因显著富集的通路有肿瘤相关通路(Pathways in cancer)、PI3K-AKT信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、细胞因子-受体相互作用通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)、RAS信号通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)及焦点粘附通路(Focal adhesion)。(图10)

A:KEGG气泡图;B:Focal adhesion基因表达量聚类热图;C:Focal adhesion蛋白互作图

3 讨论

有效抑制肿瘤细胞转移对于提高患者生存期具有重要意义。近年来,中藏药治疗肿瘤转移逐渐受到关注,其中许多方剂已被阐明具有良好的抗转移效果。解毒三根汤广泛应用于结肠癌的治疗,此药通过下调Hippo信号通路中的TAP、TAZ基因表达逆转上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),抑制结肠癌SW480细胞的侵袭和转移[1,2]。研究表明,中药补肺汤能够抑制肺癌A549细胞的转移和侵袭,其作用机制可能与抑制EMT相关蛋白的表达以及激活Smad信号通路有关[3]。中药T33作用于乳腺癌MDA-MB231、MCF-7细胞后,可显著抑制乳腺癌细胞迁移,并呈浓度依赖性[4]。本研究利用Transwell、Wound healing以及RTCA等多种实验方法验证DZYX醇提物对胃癌SGC-7901细胞迁移的影响。转录组学结果表明,DZYX醇提物与EMT相关基因存在潜在靶点,能够抑制SGC-7901细胞的迁移并影响胃癌细胞的侵袭。

肿瘤细胞转移是一个多步骤、多阶段的复杂过程。在此过程中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)起到了关键作用,MMPs通过降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中的各种蛋白质组分破坏ECM的完整性,导致肿瘤细胞向远处转移[5]。研究[6]发现,胃癌组织中的MMP-2和MMP-9表达率高达58.3%和50.0%。许多中药可以通过抑制MMPs的表达影响肿瘤细胞的转移。研究[7]发现,中药胃肠安可降低人胃癌细胞MKN45的侵袭和迁移能力,其机制可能与下调MMP2、MMP-9蛋白水平直接相关。中药隐丹参酮通过下调结肠癌CT26细胞中的MMP-2、MMP-9蛋白表达水平抑制结肠癌细胞的迁移、侵袭[8]。本研究在蛋白水平检测经DZYX醇提物处理后的人胃癌细胞SGC-7901中的MMP-2的表达情况,结果显示,细胞中的MMP-2蛋白表达水平显著降低,表明DZYX醇提物能抑制胃癌细胞中MMP-2的表达,可能是其抑制SGC-7901细胞迁移的机制之一。转录组学结果显示,DZYX醇提物同时能降低MMP-11、MMP-13、MMP-24基因的表达,提示其对胃癌细胞迁移的抑制作用与抑制MMPs的表达有关。

细胞骨架由微丝、微管和中间纤维三个部分组成,起到维持细胞结构和形状,协调细胞运动、细胞分裂和细胞内运输等作用,其中微丝由大量肌动蛋白组成,肌动蛋白以单体(G-肌动蛋白)或聚合形式(F-肌动蛋白)组成存在于细胞中[9]。研究[10]表明,重塑细胞骨架具有抑制肿瘤细胞迁移的作用,小扁豆凝集素通过降低肝癌细胞中肌动蛋白的含量使细胞骨架变得松散,重排细胞骨架可抑制肝癌细胞的迁移。研究[11]发现,脂蟾毒配基明显下调卵巢癌细胞中肌球蛋白Ⅱ表达水平,通过抑制肌动蛋白细胞骨架聚合、下调PI3K/AKT信号通路,降低卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。以上研究均证明减少细胞骨架中肌动蛋白含量、重排细胞骨架能够影响肿瘤细胞的迁移能力。本研究利用鬼笔环肽标记细胞骨架中的F-肌动蛋白,观察胃癌细胞中微丝的分布,结果发现,对照组胃癌细胞中微丝丰富,排列紧密,细胞与细胞之间相互联系,而DZYX醇提物处理组细胞中微丝含量显著减少,细胞骨架断裂成团,提示DZYX醇提物可抑制微丝聚合,重塑细胞骨架可影响胃癌细胞的迁移能力。同时转录组学中的GO功能注释及KEGG通路结果显示,DZYX醇提物能影响胃癌细胞的整合素及层粘连蛋白,且主要富集于焦点粘附通路,提示其可能为DZYX醇提物抑制胃癌细胞转移的机制。

PI3K/AKT信号通路与细胞迁移密切相关,研究证明该信号通路参与了细胞迁移过程。中药乌梅丸能够抑制胰腺癌SW1990细胞迁移,同时降低细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白的表达水平,其发挥作用机制可能与PI3K/AKT信号通路的抑制有关[12]。研究[13]表明,槲皮素通过下调PI3K/AKT中AKT的磷酸化表达水平抑制口腔癌Tca-8113细胞的迁移和侵袭。研究[14]发现,海芋乙醇提取物以剂量依赖性方式抑制黑色素瘤细胞(B16-F10、A375、A2058)的增殖、迁移和侵袭,其抗肿瘤作用与下调PTEN/PI3K/AKT信号通路的表达有关。此外,还有研究[15]表明,中药四逆散能够通过抑制NF-kappaB和AP-1上游的PI3K/AKT的激活,抑制乙型肝炎X蛋白诱导的人肝癌细胞的迁移和侵袭。因此,我们检测了PI3K/AKT通路下游中的两个关键性蛋白AKT和m-TOR发现,经DZYX醇提物处理后的胃癌SGC-7901细胞中的两种蛋白的磷酸化水平显著降低,提示DZYX醇提物能够抑制SGC-7901细胞迁移可能与抑制PI3K/AKT信号通路激活有关。

综上所述,本研究证实DZYX醇提物能够抑制胃癌细胞株SGC-7901的迁移能力,其机制可能主要与下调MMP-2、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平相关,同时可能通过整合素-焦点粘附机制抑制SGC-7901的侵袭能力。