一种分离自茶卡盐湖的盐单胞菌Halomonas chakariensis strain CH40T的新种鉴定※

崔甜琦,张田田,唐超群,朱德锐,邢江娃

(青海大学医学部,基础医学研究中心,西宁 810001)

青藏高原盐湖蕴含着独特的盐湖嗜盐微生物资源[1]。这些嗜盐微生物为适应高盐环境,能够调节胞内酶活性并产生特殊的生物活性物质,具有广泛的生物医药应用价值[1,2]。课题组从青藏高原茶卡盐湖(海拔3017 m,总矿化度322.4 g/L,pH 6.8)[3,4]的水样和底泥混合物中分离到一株中度嗜盐菌CH40T,现做相关鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株CH40T采自青海茶卡盐湖。

1.1.2 仪器及试剂

电子天平[PL203,梅特勒托利多仪器(上海)有限公司],恒温振荡培养箱(ZQTY-90S,上海知楚仪器有限公司),生化培养箱(SPX-380,宁波普朗特仪器有限公司),分光光度计(SP-754,上海光谱仪器有限公司),高速冷冻离心机(3k15,德国希格玛离心机有限公司),Illumina Hiseq、PacBio RS II单分子实时(SMRT)全基因组测序平台(上海美吉生物技术有限公司)。

细菌微量生化鉴定管(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司),API ZYM(法国生物梅里埃公司),API 50CH(法国生物梅里埃公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离纯化方法

取100 μL水样直接涂布在RM固体培养基[酵母培养基2.0 g,柠檬酸钠3.0 g,MgSO4·7H2O 20.0 g,氯化钾2.0 g,无水氯化钙0.2 g,蛋白胨10.0 g,葡萄糖7.0 g,NaCl 10%(w/v),琼脂16.0 g,加水定容至1 L,pH 7.5]上,置培养箱(37℃)中培养18～24 h后观察菌株形态。挑取形态一致的单个菌落在固体平板上重复划线(至少三次),获得纯化的单一菌株。采用RM液体培养基扩大培养后保存于-80℃冰箱中(菌液含15%甘油)。

1.2.2 16S rRNA基因的扩增及序列分析方法

提取基因组DNA,采用通用引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对16S rRNA基因进行PCR扩增和测序,最后将得到的16S rRNA基因序列提交到NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),并与EzBioCloud数据库(https://www.EzBioCloud.net)[5-7]数据进行BLAST比对,通过多位点序列分析推断菌株CH40T的系统发育关系。使用MEGA7软件[8]采用邻域连接法[9]构建系统发育树,bootstrap值为1 000[10]。

1.2.3 菌株形态特征观察方法

在RM培养基上培养(35℃)48 h,使用光学显微镜以及扫描电镜观察菌株的细胞形态和颜色,挑取单个菌落进行革兰氏染色观察,再利用KOH裂解试验验证染色结果。在RM半固体培养基上通过穿刺接种菌株,然后通过观察扩散生长现象判断其运动性。通过碱性复红法对鞭毛染色,判断是否存在鞭毛。

1.2.4 菌株生理生化特征测定方法

1.2.4.1 菌株需氧性测试

将CH40T接种在RM琼脂平板上,置厌氧培养箱(37℃)中观察第3、7、21天时的菌株生长情况。

1.2.4.2 菌株对盐度、温度及酸碱度的耐受性试验

以3% NaCl的RM液体培养基为基础培养基,测定菌株在不同温度(4、10、25、30、35、37、40、45、50℃)下的生长情况。保持培养温度(37℃)不变,在RM液体培养基中检测不同NaCl浓度[(0～21)%,w/v]和pH值(4.0～13.0)对菌株生长的影响。采用分光光度计在600 nm波长下检测菌液的吸光度值。

1.2.4.3 生理生化特征测定

使用细菌微量生化鉴定管进行以下生理生化特征的测定:氧化酶试验;过氧化氢酶试验;明胶液化试验;七叶苷、淀粉的水解试验;吲哚试验;β-半乳糖苷酶试验;甲基红试验;硫化氢试验;硝酸盐还原试验;苯丙氨酸脱氨酶、尿素酶的活性测定试验以及Voges-Proskauer(V-P)试验。

使用酪蛋白琼脂培养基进行酪蛋白水解试验。

使用API ZYM鉴定酯酶、蛋白酶等酶的活性,使用API 50CH测试碳源的利用情况。

将CH40T点接在吐温80为1%体积分数的固体培养基(蛋白胨10.0 g,NaCl 50.0 g,CaCl20.1 g,琼脂16.0 g,加水定容至1 L)上,培养(35℃)7 d,观察菌株周围有无晕圈产生。

1.2.5 脂肪酸分析及呼吸醌测定方法

将菌株送中国科学院微生物研究所进行脂肪酸分析、呼吸醌测定。

脂肪酸分析:将在RM固体培养基上培养(30℃)3 d的菌苔进行皂化,萃取皂化后的物质,使用MIDI系统分析萃取物质中的脂肪酸的类型。

呼吸醌测定:取150 mg冻干的菌体,加入40 mL的混合液(氯仿:甲醇=2:1)进行抽提,置于黑暗处,用磁力搅拌器搅拌约10 h,过滤,将滤液减压蒸干(40℃～45℃),再加入1～2 mL混合溶液(氯仿:甲醇=2:1)溶解,然后在GF254硅胶板上点样,以混合溶液[己烷:乙醚=34:6(V/V)]为展层剂进行分离,最后在紫外灯(254 nm)下将Rf=0.3～0.4的荧光带刮下重新溶解在氯仿中进行抽滤并收集滤液,利用高效液相色谱仪分析细胞醌类型。

1.2.6 全基因组测序与分析方法

基因组测序委托上海美吉生物技术有限公司完成。全基因组序列由PacBio、Illumina reads[使用Unicycler软件(版本v0.4.7)]组装。利用Glimmer、Prodigal软件对基因组中的编码序列(CDS)进行预测。利用tRNAscan-SE v2.0软件和Barrnap软件分别对基因组中的tRNA、rRNA进行预测。并与COG[11]数据库比对,获得各编码序列的COG功能注释信息。

通过NCBI获取可利用的相近物种全基因组序列,使用ChunLab在线计算器[12]计算与最近邻菌株的平均核苷酸同一性(ANI)参数,使用基因组到基因组距离计算器(GGDC 2.1)[13]计算DNA-DNA杂交(dDDH)值,判断CH40T是否为新种。

基因组中的16S rRNA和gyrB、rpoD基因连接序列采用clustal_x软件包[14],通过与相关菌株进行多重比对构建系统发育树,确定CH40T的系统发育地位。

2 结果

2.1 16S rRNA系统发育分析情况

测定菌株CH40T几乎完整的16S rRNA序列(1 528 bp),与GenBank、EzBioCloud数据库中相似的16S rRNA基因序列进行比对,构建系统发育树(图1),表明菌株CH40T属于盐单胞菌属(Halomonas)。与CH40T序列同源性最高的是H.azericaTBZ9T(99.06%),其次是H.aquamarinaS6-07T(98.73%)、H.bluephagenesisTD01T(98.17%)、H.venustaMA-ZP17-13T(97.91%)、H.ventosaeNRS2HaP1T(97.85%)和H.titanicaeGPM3T(97.85%)。CH40T与盐单胞菌属模式菌株H.elongataATCC 33173T的相似性仅有91.92%。

2.2 形态学特征

在RM培养基上的CH40T菌落呈乳白色,直径约1～2 mm,圆形,表面光滑湿润,边缘完整。细胞形状呈杆状,有周生鞭毛(图2),能运动。革兰氏染色呈阴性。

图2 细胞形态图(左)和鞭毛染色图(右)

2.3 生理生化特征

菌株CH40T为需氧菌,在温度为10℃～40℃时可生存,适合生长温度为30℃～37℃(图3)。可生存的酸碱度范围为6.0～10.0,其中酸碱度范围为11.0 ～13.0时因为碱性较高使溶液颜色加深,所以出现较高的吸光度值,但并无细菌生长,当酸碱度为7.0时,生长最快(图4)。盐度生长范围为1%～20%(w/v),最适盐度为2%～7%(w/v)(图5)。

图3 CH40T的适合生长温度

图5 CH40T的盐度生长范围

细菌微量生化鉴定管结果显示,氧化酶和过氧化氢酶试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、尿素酶试验和V-P试验等结果均为阳性,其余生化试验结果均为阴性。吐温80试验结果为阳性,酪蛋白水解试验结果为阴性。API ZYM结果显示,碱性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、亮氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-葡萄糖苷酶为阳性之外其余均为阴性。API 50CH结果显示,D-果糖、D-葡萄糖,D-木糖为可利用碳源,L-阿拉伯糖和D-甘露糖为不能被利用碳源。与盐单胞菌属相近菌株比较发现,CH40T的生存特性与H.azericaTBZ9T相似,而水解特性与碳源利用情况则分别接近于H.meridianaDSM 5425T和H.titanicaeBH1T(表1)。

表1 菌株CH40T与盐单胞菌属相近菌株的生理生化差异特征对照表

2.4 主要脂肪酸及呼吸醌

CH40T的主要的呼吸醌为CoQ-9。主要脂肪酸成分为C18:1w7c(46.07%),C16:0(17.87%),C16:1w7c/16:1w6c(20.47%),C12:03OH(6.52%)。

2.5 全基因组分析情况

菌株CH40T全基因组大小为3.76 Mbp(图6),DNA G+C的含量为55.7%,共预测到3 375个CDS和79个RNA基因,后者共包括61个tRNA和18个rRNA基因(表2)。基因注释表明氨基酸转运与代谢(E),复制、重组和修复(L)及信号转导机制(T)是最丰富的COG,分别占8.84%、6.47%和6.40%。

表2 测序平台及全基因组分析情况

最外面一圈为基因组大小的标识,向里依次为正负链上的CDS、rRNA和tRNA、GC含量及GC-Skew值

为了确定菌株CH40T的物种分类学地位,我们通过NCBI获取可利用的相近物种全基因组序列,测定了与最近邻菌株的ANI、dDDH值。菌株CH40T与H.azericaTBZ9T、H.bluephagenesisTD01T、H.titanicaeGPM3T、H.ventosaeNRS2HaP1T、H.venustaMA-ZP17-13T的ANI值依次为94.63%、74.01%、74.36%、74.07%和73.48%,dDDH值依次为57.80%、20.80%、21.10%、21.10%和20.90%(表3),均低于ANI 95%和dDDH 70%的标准阈值[18,19]。上述结果表明菌株CH40T是盐单胞菌属中的一个新物种。

表3 菌株CH40T和与其近邻菌株的ANI、dDDH值

其他标记基因如gyrB(DNA gyrase B subunit)、rpoD(RNA polymerase sigma factor)被认为是能够高度区分Halomonas物种的工具[20]。本研究从CH40T的基因组测序中获得了gyrB(2421 bp)、rpoD(1851 bp),利用EzBioCloud服务器分析gyrB、rpoD的序列相似性,利用GenBank数据库检索gyrB和rpoD的相似序列,然后进行系统发育分析。相比于16S rRNA基因序列,CH40T与邻近株gyrB和rpoD基因序列的相似性较低,分别为72.39%～80.41%和78.78%～85.18%。基于16S rRNA和gyrB、rpoD基因序列的邻域连接树显示,CH40T聚集在盐单胞菌属内(图7)。

图7 基于16S rRNA、gyrB和rpoD基因序列的邻域连接树

3 讨论

近年来,国内外均有一些新种盐单胞菌被发现,发现者对菌株做了详尽的种属鉴定和生理生化特征研究[21,22]。盐单胞菌属是盐单胞菌科的最大属[23],最早由Vreeland等描述[24],目前发表确认的物种有117个(http://www.bacterio.net/halomonas.html)。盐单胞菌在盐场、盐湖以及盐碱地等特殊的极端盐环境中分布较多[25],作用广泛,可做各种生物技术应用[26],如污水和土壤的改良[27]、四氢嘧啶等次级代谢产物的合成[28]、生物酶的利用[29]和可降解生物塑料的产生[30]等,近年来受到越来越多的关注。

本研究从青海茶卡盐湖的水样和底泥混合物中分离到一株中度嗜盐菌CH40T,根据16S rRNA基因序列相似性比对、生理生化特性测定、全基因组测序、系统发育分析和ANI、dDDH分析等实验认定,CH40T为盐单胞菌属的一个新种,命名为茶卡盐单胞菌(Halomonaschakariensis)。CH40T可以耐受较宽的盐浓度范围,且其生长对盐具有依赖性。CH40T具有产淀粉酶、尿素酶、酯酶等功能酶的能力,这些酶作为嗜盐酶,相比于普通酶类,在高盐环境中具有更好的稳定性和活性[31],具有重要的研究和应用价值。与此同时,CH40T作为中度嗜盐菌,在应对盐胁迫时,其调控机制复杂,很可能伴随着各种相容性溶质的产生,如四氢嘧啶、甜菜碱、氨基酸等[32],具有广阔的应用前景。因此,在后续的研究中,可对CH40T的功能酶、盐境适应机制以及溶质合成等方面进行深入研究,挖掘其潜在的应用价值。