通过PI3K/Akt信号通路调控p21对放射性肺损伤的防护作用*

杨 依,陈 凡,冯瑞兴,郝彦惠,高 悦

(1.青海大学医学部,西宁 810001;2.青海大学附属医院,西宁 810001)

放射性肺损伤(Radiation-induced lung injury,RILI)是胸部放射治疗最常见并发症[1],它的防治在国内外相关领域是一道学术难题。因此,能够降低RILI的发生,对提高患者的生存率和生活质量具有积极意义。

多项研究表明,PI3K/Akt信号通路是RILI发生的关键通路并参与RILI的发生,当接收到辐射刺激时,PI3K活化,激活Akt,活化的Akt可激活下游多种信号分子[2]。通过阻断该信号通路,抑制PI3K、Akt磷酸化,抑制该通路中各分子的表达,可减轻肺损伤[3,4]。p21蛋白属于PI3K家族,是PI3K/Akt信号通路下游的效应蛋白[5]。LY294002是细胞实验及动物实验中广泛使用的PI3K/Akt信号通路抑制剂,能够抑制PI3K、Akt的磷酸化,从而阻碍通路的激活[6]。在高原环境下,有关通过PI3K/Akt信号通路调控p21对RILI的防护作用未见报道。

本研究基于小鼠RILI模型,在抑制PI3K/Akt信号通路的基础上,探讨通过PI3K/Akt信号通路调控p21对RILI的防护作用,为临床防治RILI提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

56只C57BL/6小鼠,SPF级,6～8周龄,体质量18～20 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号为SCXK(京)2021-0006。在青海大学高原医学中心实验室动物房饲养,温度为20℃,湿度为50%～60%,所有动物实验程序遵守国家动物实验管理的政策法规和实验动物伦理福利原则。

1.1.2 主要试剂及仪器

医用电子直线加速器(23EX,美国Varian医疗系统公司),PI3K抑制剂LY294002(HY-10108,美国MCE公司),PI3K抗体(YM3504,美国Immunoway公司),p-Akt抗体(YP0006,美国Immunoway公司),p21抗体(Bs-55160R,北京博奥森有限公司),高速冷冻离心机(MiCrofuge 22R,美国Beckman公司),石蜡包埋机(Arcadia H,德国Leica公司),石蜡切片机(RM2245,德国Leica公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药方法

小鼠适应性喂养7 d,将56只小鼠均分为7组:对照组、10Gy组、10Gy+LY294002组、15Gy组、15Gy+LY294002组、20Gy组、20Gy+LY294002组。根据文献[7]所示方法使用LY294002。

1.2.2 照射方法

将麻醉小鼠固定于特制固定板上,采用医用电子直线加速器照射胸部(6MV-X线,单次胸部剂量分别为10、15、20 Gy,剂量率为300 cGy/min,源皮距为100 cm)。小鼠头部和腹部用多叶光栅遮挡。

1.2.3 HE染色方法

将肺组织从4%多聚甲醛中取出行常规操作。

1.2.4 IHC方法

取肺组织以常规方法制作切片。染色的阳性细胞呈棕黄色或深褐色。

1.2.5 RT-PCR方法

采用Trizol法从小鼠肺组织中提取总RNA,反转录成cDNA,根据SYBR PCR试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR实验。实时荧光定量PCR实验采用两步法,第一步:在95℃条件下预变性30 s,循环1次;第二步:在95℃条件下预变性10 s,在60℃条件下预变性30 s,循环40次。p21上游引物为5′-CAGCTCAGGACTGGAAGG-3′,下游引物为5′-TCCGGAGGGTCTCGTAAGAT-3′,GAPDH上游引物为5′-TGATGGGTGTGAACGAG-3′,下游引物为5′-GGTGTCAGGTACGGTAGTGA-3′,以GAPDH为内参,用2-△△Ct法计算p21mRNA相对表达水平。

1.2.6 Western Blot方法

取冷冻的肺组织样本提取组织蛋白,经转膜封闭后依序加入一抗(p21、PI3K、p-Akt)和二抗后曝光显影。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠体质量变化情况

对照组体质量增加明显;与对照组比,各单纯照射组小鼠体质量随剂量增加明显减轻,P<0.05;与15Gy、20Gy组比,15Gy+LY294002、20Gy+LY294002组体质量增加,P<0.05。(表1)

表1 各组小鼠的体质量

2.2 小鼠肺组织病理变化情况

HE染色切片显示,对照组小鼠肺组织结构清晰,肺泡形态正常,肺泡壁薄;10Gy组可见局部少量炎细胞浸润及异型细胞,肺泡间隔增宽不明显;10Gy+LY294002组可见炎细胞浸润减少(较10Gy组);15Gy组可见炎细胞浸润(明显),少量细胞水肿,部分细胞核深染,还发现异型细胞(明显);20Gy组可见肺泡上皮细胞增生、肺泡间隔增宽、细胞核深染、炎细胞浸润;15Gy+LY294002、20Gy+LY294002组小鼠的RILI较15Gy、20Gy组减轻。 (图1)

图1 各组小鼠肺组织HE染色图(HE,×100)

2.3 小鼠肺组织p21阳性细胞表达情况

IHC染色切片显示,p21在正常肺组织中几乎无表达;与对照组相比,各单纯照射组小鼠肺组织p21阳性细胞随剂量增加而逐渐增多;与单纯照射组相比,同剂量照射+LY294002组小鼠肺组织p21阳性细胞随剂量增加而相对减少。(图2)

图2 各组小鼠肺组织IHC染色图(×200)

2.4 小鼠肺组织p21吸光度和p21mRNA表达的情况

与对照组相比,各单纯照射组小鼠肺组织p21吸光度值较高、p21mRNA相对表达量较高;与单纯照射组相比,同剂量照射+LY294002组小鼠肺组织p21吸光度值较低、p21mRNA相对表达量较低。(表2)

表2 各组小鼠肺组织p21吸光度和p21mRNA表达量

2.5 小鼠肺组织蛋白表达情况

与对照组相比,各单纯照射组小鼠肺组织p21、PI3K、p-Akt相对蛋白表达量均为高表达,P<0.05;与单纯照射组相比,同剂量照射+LY294002组小鼠肺组织p21相对蛋白表达量均为低表达,P<0.05;同剂量照射+LY294002组小鼠肺组织PI3K相对蛋白表达量均为低表达,P<0.05;同剂量照射+LY294002组小鼠肺组织p-Akt相对蛋白表达量均为低表达,P<0.05。(表3,图3)

图3 各组小鼠肺组织相对蛋白表达量的电泳图

表3 各组小鼠肺组织p21、PI3K、p-Akt相对蛋白表达量

3 讨论

早期发现,PI3K/Akt信号通路抑制导致许多恶性肿瘤被异常激活[8,9]。PI3K/Akt信号通路在肺癌细胞增殖中起重要作用[10]。研究发现,PI3K/Akt信号通路与相关大鼠RILI机制有关(PI3K、Akt磷酸化,介导损伤的肺细胞凋亡)[11],与本研究结果一致。Tsoyi[12]等研究发现,通过调节PI3K/Akt信号通路,可抑制成纤维细胞活化并减轻辐射诱导的肺纤维化。肺组织炎症因子可激活PI3K/Akt信号通路,可促进肺泡上皮细胞转化为肺间质细胞,表明PI3K/Akt信号通路参与放射性肺纤维化的形成[13]。而且PI3K抑制剂还可以克服肺癌放射治疗中的耐药性,因此准确识别受益于PI3K治疗的患者群体是研究的重点[14]。研究发现,由LY294002干预的衰老细胞中的PI3K、p-Akt、p21表达水平明显降低。PI3K-Akt是上调p21的激酶,参与细胞内多种信号的激活[15],与本研究结果一致。单纯照射组p21蛋白表达水平升高,而加入PI3K/Akt信号通路抑制剂后表达降低,小鼠放射损伤程度减轻。本实验采用小鼠全肺单次照射10、15、20 Gy的X射线,建立RILI模型[16-18]。单纯照射组随着剂量增加,小鼠肺组织出现不同程度的损伤,而同剂量照射+LY294002组小鼠的肺组织损伤相对较轻。表明抑制PI3K/Akt信号通路下游p21蛋白表达水平能够有效预防或减轻RILI的发生。

综上所述,通过抑制PI3K/Akt信号通路可降低小鼠肺组织p21表达,对小鼠RILI具有防护作用。