复合杂合突变导致遗传性蛋白C 缺陷症一家系调查*

孙维杰，徐琦煜，王峰，徐全军，周伟，陈慧敏，牧启田（.宁波大学附属第一医院检验科，浙江宁波 3500；.温州医科大学附属第一医院医学检验中心，浙江温州 3505）

蛋白C（protein C，PC）作为机体内重要的生理性抗凝物质，是一种维生素K 依赖性丝氨酸蛋白酶原，主要由肝细胞合成并以一种无活性酶原的形式释放至血浆中［1］。PC 缺陷症的诊断主要依靠实验室检查，如PC 活性（PC：A）和PC 抗原（PC：Ag）的测定。包括PC、蛋白S（protein S，PS）以及抗凝血酶（antithrombin，AT）在内的生理性抗凝蛋白缺陷是遗传性易栓症的主要病因。PC 缺陷症导致的家族性易栓症由Griffin 等［2］于1981 年首次报道，之后越来越多的研究证实PC 缺陷症是易栓症的高危因素。这类疾病的临床表现主要以静脉血栓栓塞为主，其中深静脉血栓栓塞和肺栓塞最常见［3］。本研究旨在观察并分析复合杂合突变导致遗传性PC 缺陷症家系的临床特征以及PROC基因的突变情况。

1 资料与方法

1.1 病历资料 先证者男，27 岁，2020 年12 月因“肩肋部疼痛2 d，咳嗽伴痰中带血2 d”就诊于温州医科大学附属第一医院。追问有无出血史或血栓史，得知先证者1 年前曾因肠系膜静脉血栓形成在宁波大学附属第一医院血管外科保守治疗好转后出院，出院后间断口服利伐沙班进行抗凝治疗。常规凝血检查示先证者PC：A 降至27%（参考区间70%～130%），初步诊断为PC 缺陷症。其父母和妹妹肺动脉造影及双下肢深静脉B 超检查均未发现异常。本次住院时先证者及其家系成员均进行血浆PC 水平及PROC基因检测。选择温州医科大学附属第一医院2020 年10 月至12 月就诊且无肝肾功能异常，无出血及血栓史的体检健康者100 例作为健康人对照，其中男53 例，女47 例，年龄16～60 岁（中位年龄32 岁）。所有受试者均签署知情同意书，并经宁波大学附属第一医院医学伦理委员会批准（伦审2012-17）。该先证者家系图谱见图1。

图1 遗传性PC 缺陷症家系图

1.2 主要仪器及试剂 STA-Max 全自动血凝仪（法国Stago 公司），DeNovix DS-11 超微量分光光度计（美国DeNovix 公司），ABI 2720 PCR 扩增仪、ABI PRISM 3700 测序仪（美国Applied Biosystems 公司）。PT、APTT 和PC：A 凝血试剂（法国Stago 公司），DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技公司）。

1.3 样本采集和处理 采集先证者及家系成员就诊时的空腹外周静脉血2.7 mL，109 mmol／L 枸橼酸钠1 ∶9 抗凝，8 ℃、3 000 r／min 离心10 min，离心后上层乏血小板血浆立即用于检测各项凝血指标；其余部分按照DNA 提取试剂盒说明书提取外周血单个核细胞的基因DNA，并置于-40 ℃保存。

1.4 实验室表型检测 按照STA-Max 全自动血凝仪说明书，采用凝固法检测血浆凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、纤维蛋白原（fibrinogen，Fib）和PS 活性（PS：A），发色底物法检测PC：A 和AT 活性（AT：A）。

1.5 DNA 提取及基因测序分析 提取先证者及家系成员基因组DNA，使用DS-11 超微量分光光度计检测基因组DNA 的纯度和浓度，取纯度（A260nm／A280nm）约为1.8，浓度为50 ng／μL 的DNA 样本，置于-40 ℃保存。PCR 扩增先证者PROC基因（Gen-Bank：AF378903）所有外显子及侧翼序列，利用Primer-BLAST（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／tools／primer-blast／）设计引物，并由上海桑尼生物技术有限公司合成，引物序列见表1。PCR 反应体系为25 μL，包括1×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，双蒸水7.5 μL，50 ng／μL DNA 模板3 μL，10 μmol／L 上、下游引物各1 μL。PCR 扩增反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，根据不同引物的退火温度相应退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物经15 g／L 琼脂糖凝胶电泳进行特异性鉴定，紫外光下观察为单一明亮条带。电泳阳性产物经纯化后送上海桑尼生物技术有限公司测序。

1.6 生物信息学分析 应用多序列比对软件ClustalX-2.1-win 对多种同源性物种氨基酸突变位点的保守水平进行研究。同源性物种的氨基酸序列来源网址：http：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／homologene；使用在线生物信息学软件PROVEAN（http：／／provean.jcvi.org／index.php）预测突变的致病性。

2 结果

2.1 凝血指标检测结果 先证者常规凝血指标检查PT、APTT、Fib、PS：A 及AT：A 均在参考区间内，D-二聚体（D-D）为6.22 mg／L，PC：A 降至27%。先证者的父亲、母亲和妹妹的PC：A 分别降低至67%、63%和60%。先证者及其家系成员实验室表型检测结果见表2。

表2 遗传性PC 缺陷症家系成员表型和基因型检测结果

2.2 基因测序结果 先证者PROC基因第7 号外显子存在 c.541T ＞G 杂合错义突变导致p.Phe181Val和c.577-579delAAG 杂合缺失突变为p.Lys192deletion，其父亲为c.541T＞G 突变杂合子，母亲和妹妹为c.577-579delAAG 突变杂合子，外祖父为野生型，见图2。

图2 PROC 基因第7 号外显子测序结果

2.3 生物信息学预测结果 保守性分析显示，Lys192 和Phe181 在同源物种间高度保守（图3）；PROVEAN 软件预测c.577-579delAAG 杂合错义突变和c.541T＞G 杂合缺失突变均为有害突变，得分分别为-2.88 分和-4.67 分（得分≤-2.5 分为有害突变；＞-2.5 分为中性突变）。

图3 p.Lys192（A）和p.Phe181（B）位点保守性分析结果

3 讨论

近年来，随着检验技术和手段的进步，PC 缺陷症的发病率逐年升高，杂合子型携带者在人群中的发病率为1／500～1／200，而纯合子型在人群中的发病率约为1／4 万～1／2.5 万［4］。截止至2023 年1 月，人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database，HGMD）记录了300 多个PROC基因突变，其中错义／无义突变占主要部分。本例先证者基因测序发现PROC基因第7 号外显子存在c.541T＞G 错义突变和c.577-579delAAG 缺失突变。c.541T＞G 错义突变在dbSNP 数据库中的编号为rs199469470，GnomAD-exome 数据库、ExAC 数据库以及ALFA 数据库显示此错义突变在人群中的突变频率分别为0.000 052、0.000 025 及0.000 00。c.577-579delAAG 缺失突变在HGMD 公开版数据库中已有收录该位点PC 缺陷症的致病性报道（ID：CD004314）。临床上根据PC 活性和抗原降低水平的不同，PC 缺陷症分为两种类型：Ⅰ型指PC 合成减少，即血浆PC 活性和抗原含量同步降低；Ⅱ型指合成了异常的PC 分子，即PC 活性水平降低，但抗原含量正常或增高。Ⅱ型又可以进一步分为Ⅱa 型和Ⅱb 型；其中Ⅱa 型指抗原含量正常，抗凝活性及酰胺水解活性降低；Ⅱb型指抗原含量正常，抗凝活性下降［5］。约75%的PC 缺陷症患者属于Ⅰ型，是静脉血栓形成公认的危险因素；Ⅱ型PC 缺陷症约占24%，其中Ⅱb 型PC 缺陷症十分罕见。多项文献报道，c.541T＞G 错义突变引起Ⅰ型PC 缺陷症［6］；c.577-579delAAG 缺失突变引起Ⅱ型PC 缺陷症［6-7］。

本例先证者既往有血栓史，胸部CT 肺动脉造影显示肺栓塞，下肢静脉造影提示下腔静脉及右髂总静脉、两侧髂内静脉血栓形成，PC：A 降至27%，PROC基因第7 号外显子存在复合杂合突变，保守性分析结果显示Phe181 和Lys192 位点在同源物种间均高度保守，表明该2 个位点氨基酸是PC 蛋白发挥正常作用的重要功能位点；生物信息学软件预测c.541T＞G 错义突变和c.577-579delAAG 缺失突变均为有害突变，推测该复合杂合突变可能导致蛋白质合成减少、稳定性下降或分泌障碍，引起血浆PC 水平降低，是导致患者发生肺栓塞的重要原因之一。其他家系成员为单杂合突变且PC：A 略有降低，目前尚无血栓形成事件发生。结合本案例，先证者有肠系膜静脉血栓史，应引起临床医生的高度重视，对于无明显诱因反复发作或发病年龄较低的静脉血栓栓塞患者，应进行PC：A、PS：A 和AT：A 的普查以及血栓相关基因检测（PROC基因、PROS1基因及SERPINC1基因）。确定存在生理性抗凝蛋白缺陷，则需进一步对家系其他成员进行相关基因筛查。PC 和PS 都属于维生素K 依赖的蛋白质，对于遗传性PC 缺陷症患者推荐使用利伐沙班等新型抗凝药物进行治疗，对于确诊易栓症的患者，建议终生抗凝治疗以预防血栓性疾病的发生，对于未发生血栓形成事件的遗传性PC 缺陷症携带者，是否进行抗凝治疗来预防血栓栓塞，目前尚无定论。