PD-1／PD-L1 信号调节在类风湿性关节炎的研究进展*

殷淑瑛，吕巧怡，王荟，邵启祥，2（.江苏大学医学院，江苏镇江 2203；2.江苏护理职业学院医学技术学院，江苏淮安 223005）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是常见的自身免疫性疾病，约影响全球0.5%～1.0%的成年人，RA 的发病机制复杂，目前认为与环境因素，DNA 甲基化，免疫耐受被打破，T、B 细胞功能失调以及免疫炎症等密切相关［1-2］。近年来有关程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）／PD-L1 信号在RA 病程中的作用机制、临床检测方法和靶向治疗方面有了长足的进展，本文就上述研究进展作一综述。

1 RA 患者PD-1／PD-L1 信号调节T 细胞功能的机制

研究发现，PD-1 分子的表达与RA 疾病进程有关，PD-1在RA 活动期的表达水平显著高于RA 缓解期，即使在缓解期，PD-1 的表达水平也明显高于健康人对照［3］。尽管PD-1在RA 患者滑膜组织及外周血T 细胞、B 细胞和DCs 等细胞表面呈高表达，但相关研究表明PD-L1 在RA 患者滑膜组织中的表达降低，且RA 患者血清或滑膜液中存在可溶性PD-1（soluble programmed death 1，sPD-1）、sPD-L1 或PD-1 蛋白自身抗体等干扰PD-1／PD-L1 信号通路的分子［4-6］，导致PD-1信号不能发挥负向调控作用。另外，参与RA 致病的免疫细胞的分化、代谢、功能调控也受到PD-1／PD-L1 通路的调控［7］。目前，针对PD-1 的人源化免疫球蛋白G1 单克隆抗体Peresolimab 在RA 患者的Ⅱ期临床试验已显示出较好的治疗效果［8］。由此可见，明确PD-1／PD-L1 信号对RA 病程进展的影响机制至关重要。

1.1 sPD-1 对RA 患者T 细胞PD-1／PD-L1 信号的调控sPD-1 由mRNA 的剪接或膜蛋白的裂解产生，是PD-1／PD-L1信号通路的阻断剂，当sPD-1 与PD-L1 特异性结合，可阻断PD-1／PD-L1 通路负性信号的转导。既往研究表明，sPD-1在慢性感染、抗肿瘤免疫和自身免疫性疾病中发挥重要作用。在RA 患者滑膜液和血清中sPD-1 的浓度显著高于健康人对照组，且与DAS28 评分和临床活动期有关，经过治疗后的RA 患者血清sPD-1 的浓度显著降低［9］。sPD-1 抑制负向调控机制可能是过多的sPD-1 竞争性结合细胞表面PD-1配体，使得PD-1 结合配体相对减少，抑制PD-1 的负性调控作用，加快、加剧关节炎的发生和关节损伤。另外，RA 的发生、发展与促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-21 和IL-17A）的产生有关，有学者发现，这些炎性因子作用于T细胞可诱导sPD-1 的产生，经腹腔注射PD-1 蛋白至CIA 小鼠模型可使小鼠体内TH1／TH17 数量增加，导致TH1／TH17 比例失衡，关节严重受损［10］。综上所述，sPD-1 通过阻断PD-1 信号通路的转导或使TH1／TH17 比例失衡，加速RA 进展。

1.2 信号淋巴细胞活化分子相关蛋白［signaling lymphocytic activation molecule（SLAM）-associated protein，SAP］对RA 患者T 细胞PD-1／PD-L1 信号的调控 T 细胞是介导自身免疫性疾病的关键细胞，RA 患者外周血和滑膜组织中CD3+T细胞中PD-1 的表达水平显著高于健康人对照组，并且与疾病活动度呈正相关［11］，这表明随着RA 患者病情的进展，疾病活动度越高则PD-1+T 细胞比例越高。PD-1 作为负向调控分子在RA 患者T 细胞中呈高表达，但并没有发挥其负向调控作用。因此，Sandigu 等［12］推断PD-1 信号在RA 疾病进展中被阻断，具有阻断PD-1 信号的SAP 高表达于RA 患者T 细胞，且与疾病活动性密切相关。SAP 作为一种间接的“分子屏障”使PD-1 下游信号免疫受体酪氨酸转换基序（immuno-receptor tyrosine-based switch motif，ITSM）酪氨酸残基不受含Src 同源性2 的蛋白酪氨酸磷酸酶2（SH2 domaincontaining protein tyrosine phosphatase-2，SHP2）活性的影响，阻止了SHP2 与PD-1 的相互作用，抑制PD-1 信号在T 细胞的负向调控功能［13］。这可能是PD-1 在RA 中不能发挥负向调控作用的另一原因。

2 PD-1／PD-L1 对CD4+T 细胞功能的影响

2.1 PD-1／PD-L1 对滤泡辅助性T 细胞（follicular helper T cells，Tfh）功能的影响 Tfh 是1 个特化的T 细胞亚群，其特征是高表达C-X-C 基序趋化因子受体5（C-X-C motif chemokine receptor type 5，CXCR5）、PD-1、诱导性共刺激分子（inducible costimulatory molecule，ICOS）、CD40L 和IL-21 等分子，这些分子可促进Tfh 发育并迁移到生发中心，辅助B 细胞分化发育，从而产生抗体［14］。在此期间，Tfh 功能缺陷或亢进都会导致机体免疫功能紊乱。Tfh 功能亢进对B 细胞产生过强的辅助信号，使自身反应性B 细胞活化，分泌大量针对自身抗原的抗体，导致RA、SLE 等多种自身免疫性疾病的发生。在Tfh 发育过程中PD-1 信号起着重要的调控作用，初始T 细胞（naïve T cells，Tn）进入T-B 细胞交界区发育是由CXCR5-磷酸肌醇3 激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）信号介导的，而PD-1／PD-L1 相互作用则可抑制该信号，使高表达PD-1 的Tn 发育为Tfh 的数量下降［15］。另外，ICOS 信号是调节Tfh 功能的另一种重要信号的分子，ICOS缺陷患者的鸟苷酸环化酶（GC）形成受损，且Tfh 和记忆B细胞数量减少［16］，而ICOS 的表达增加会使Tfh 的比例增加，促进B 细胞向浆细胞分化，产生大量自身抗体，从而导致自身免疫性疾病［17-18］。另有研究表明，PD-1 可下调ICOS信号，从而抑制淋巴滤泡中Tfh 的增殖，避免B 细胞过度增殖和抗体产生［19］。因此，PD-1 是Tfh 发育过程中有效的负向调节因子。

2.2 PD-1／PD-L1 对外周辅助性T 细胞（peripheral helper T cells，Tph）功能的影响 Tph 是在抗环瓜氨酸化蛋白抗体阳性的RA 患者滑膜中发现的一种CD4+T 细胞亚群，该亚群通过分泌趋化因子C-X-C 基序趋化性细胞因子配体13（C-X-C motif chemokine ligand 13，CXCL13），促进炎症部位淋巴滤泡和三级淋巴样结构（tertiary lymphoid structure，TLS）的形成，并辅助B 细胞的发育，进而加重RA 的病情［20-21］。据文献报道，促炎因子TNF-α 和IL-6 可上调CXCL13的表达，而PD-1／PD-L1 信号具有负向调控CXCL13分泌的作用；当使用抗PD-L1 或PD-L2 的单抗阻断PD-1 信号后，Tph 增殖加速以及CXCL13 的表达增加［22］。在RA 患者滑膜中，与PD-1-T 细胞相比，PD-1hiCXCR5-Tph 中IL-21、CXCL13、IFN-γ和IL-10mRNA 的表达量显著增加，说明其具有辅助B 细胞分化的功能。在淋巴聚集体中，PD-1hiCXCR5-T细胞和PD-1hiCXCR5+T 细胞均与B 细胞相邻；而在淋巴聚集体以外的区域，与B 细胞相邻的大多数是PD-1hiCXCR5-T 细胞。以上结果表明PD-1hiCXCR5-T 细胞具有独特的能力，可以在淋巴聚集体和炎症滑膜中广泛与B 细胞相互作用，促进B 细胞分化为浆细胞并产生抗体［23］。Tph 的这种作用也存在于SLE 患者中，其频率与疾病活动性相关，并可促进B 细胞表达靶向外周组织的迁移受体，由此可见，Tph 在SLE 中也具有病理潜能［24］。

2.3 PD-1／PD-L1 对调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）功能的影响 Treg 是体内具有免疫抑制功能的，以表达叉头状／翼状螺旋转录因子3（forkhead box protein 3，Foxp3）、CD25hi为特征的CD4+T 细胞亚群，其缺失或功能异常可导致自身免疫病的发生［25］。研究发现，PD-1／PD-L1 信号途径可调控Tn 向Treg 的分化。Tn 在PD-L1 包被的磁珠和TGF-β的作用下，可下调蛋白激酶B（protein kinase B，PKB／Akt）／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路，同时上调磷酸酶和紧张素P 同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）等Treg 发育的关键信号分子，从而促使Tn 分化为Treg［26］。另外，Gotot 等［27］通过一系列过继转移试验发现，表达PD-L1 的Treg 通过PD-1／PD-L1信号依赖的方式抑制自身反应性PD-1+B 细胞的活化和自身抗体的产生。在RA 的发展过程中，Treg 比例降低，功能受到抑制，经过甲氨蝶呤治疗后患者Tn 向Treg 分化比例增加，疾病进程得到缓解［28］。因此，通过PD-1／PD-L1 信号通路诱导Treg 可能是治疗RA 的一种新的策略。

3 PD-1 信号调节CD8 记忆T 细胞的产生和代谢

组织驻留记忆T 细胞（tissue-resident memory T cells，Trm）是以CD103 和CD69 为表型的第三类记忆T 细胞亚群，被认为是RA 复发的关键驱动因素。在RA 患者的滑膜组织中高表达PD-1 的CD8+Trm 比例增加。研究表明，PD-1信号调节CD8+T 细胞记忆的形成和维持，与野生型小鼠相比，PD-1 缺失的小鼠在CD8+T 细胞记忆维持阶段数量减少，使得淋巴区和非淋巴区CD8+Tm 显著减少［29］。另外，TCR 信号强度与Tm 细胞的形成呈负相关，PD-1 信号的丢失会增强TCR 信号，使Tm 数量和功能受损［30］。在代谢方面，PD1 信号轴通过调节mTOR 依赖的糖酵解和脂肪酸氧化途径，满足静息CD8+Tm 的能量需求，促进CD8+Tm 的发育和稳态维持。上述结果表明，PD-1 是Tm 形成和代谢维持的调节剂［29］。

4 RA 患者PD-1／PD-L1 信号调节B 细胞功能的机制

约2／3 的RA 患者产生抗环瓜氨酸蛋白和／或变性免疫球蛋白（类风湿因子）的抗体。高水平和持续产生自身抗体表明B 细胞在RA 发病机制中起重要作用［31］。CXCR3 是记忆B 细胞迁移到滑膜炎症部位重要的趋化因子受体。大多数表达CXCR3 的B 细胞在体外激活后可表达PD-1。与PD-1-B 细胞相比，PD-1+B 细胞具有更高的T 细胞共刺激能力和促炎性细胞因子产生能力［32］。PD-1+B 细胞参与糖酵解的基因显著上调，Akt／mTOR 通路显著激活，葡萄糖摄取显著增加，在阻断糖酵解途径后PD-1+B 细胞消失，但目前其具体机制尚不清楚［33］。另有研究表明，在缺乏PD-1 信号的情况下（如PD-1 和PD-1 配体缺乏）导致长寿命浆细胞生成不足，数量减少，由于浆细胞分化本身不受PD-1 信号的影响，晚期生发中心更侧重于产生长寿命浆细胞［34］。长寿命浆细胞可以在骨髓中存活数个月至数年，即使在缺乏自身反应性T 和B 淋巴细胞慢性激活的情况下，长寿命浆细胞也可继续分泌自身抗体［35］。消除自身抗原特异性的长寿命浆细胞对开发新的免疫治疗策略可能是一种新的方向。

5 PD-1／PD-L1 检测技术的研究进展

传统的PD-1／PD-L1 检测方法包括免疫组织化学技术（IHC）、Western blot、ELISA 和流式细胞术（FCM）等。传统方法均存在一定的局限性，例如IHC 是有创性检查，重复性差，其结果判读具有一定的主观性，易误诊为假阴性结果［36］，Western blot 需要较高浓度的蛋白质，在实际应用中并不敏感［37］；ELISA 法需要昂贵的抗体来捕获和标记靶标，且抗体的质量存在差异［38］；FCM 检测主要应用于外周血检测，对于组织检测在临床应用中有一定的限制性；此外由于个体差异较大，正常参考值的确定比较困难。PD-1／PD-L1表达水平在临床自身免疫病和肿瘤等疾病诊断和治疗中具有重要价值，有望为疾病的靶向治疗提供参考。因此，开发高灵敏度、高精度，适合临床的检测方法具有十分重要的意义。目前，除了经典方法以外，RNAscope 技术、正电子发射断层扫描（positron emission tomography，PET）、液相色谱-串联质谱技术（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS／MS）等多种方法已应用于PD-1／PD-L1 的检测。

5.1 RNAscope 技术在PD-1／PD-L1 检测中的应用 RNAscope 技术由美国ACD 公司开发，用于检测目的RNA 原位定量杂交的新技术。它克服了IHC 因抗体质量、抗体来源及检测条件等因素不同造成检测结果不准确的缺点，通过设计特异性的探针，几乎可实现对所有基因的检测，具有灵敏度高、特异性强、信噪比高等优势。研究发现，RNAscope技术在PD-1／PD-L1 检测中与IHC［39］、PCR 和二代测序［40］等检测方法具有较好的一致性。

5.2 PET 技术在PD-1／PD-L1 检测中的应用 PET 是一种无创、精准、实时、可重复的成像技术，其检测体内PD-1 分子的原理是利用放射性核素标记抗PD-1 抗体或抗体片段制成分子探针，引入活体后，探针靶向识别体内的PD-1 分子，然后利用PET 对体内的放射性摄取进行测量，实现对体内PD-1 分子的定量检测［41］。PET 探针是PET 影像学研究的先决条件，当核素标记抗PD-1 单克隆抗体作为探针显像时，其识别PD-1 分子的亲和力强，制备方法简单，但不易被机体迅速代谢，且穿透能力差限制了其临床应用。核素标记低分子量PD-1 抗体片段、纳米抗体显像时，其穿透性强，半衰期短可被机体快速清除，已展现出巨大的发展潜力，然而，核素标记低分子量PD-1 抗体片段、纳米抗体也存在制备复杂、稳定性较差、开发成本较高等短板［42］。

5.3 LC-MS／MS 技术在PD-1／PD-L1 检测中的应用LC-MS／MS作为一种灵敏度高、准确性好的蛋白质定量技术，可独立进行蛋白质的定量分析，已被广泛应用于临床。在PD-1 和 PD-L1 的检测过程中，Zheng 等［43］利 用LC-MS／MS检测方法首次使用自动抗肽抗体测定福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed and paraffin-embedded，FFPE）组织中PD-1 和PD-L1 的含量，该方法提高了对FFPE 组织检测的灵敏度和特异性。在另一项研究中［44］，研究人员开发了一种完全自动化、超靶向的双向液相色谱与串联质谱联用技术（two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry，2D-LC-MS／MS）分析血清中的PD-L1 蛋白含量，其灵敏度比传统LC-MS／MS 高出100 倍。由于该方法灵敏度高，可对目标物质进行准确的定量检测。

6 小结及展望

PD-1／PD-L1 是机体免疫系统的强大调节分子信号，RA患者外周血、滑膜腔中的T、B 细胞直接或间接受sPD-1、PI3K／Akt／mTOR、ICOS 等PD-1／PD-L1 上、下游多种信号分子的调节，从而影响RA 的临床表现。目前，在临床Ⅱ试验中，PD-1 抗体治疗RA 已显示出较好的疗效。因此，通过有效的PD-1 抗体药物治疗，联合先进的检测方法评估PD-1／PD-L1 的表达，有望为临床治疗RA 带来新的希望和路径。