何首乌致肝损伤标志物HLA-B*35：01 等位基因的汉族人群分布*

邵静茹，曹丹，邬彩红，潘英芳，刘艳，朱传福，聂向民（.山东省血液中心HLA 研究室，济南 5004；.泰安市中医医院脑病科，山东泰安 700）

药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）是指由各类化学药物、传统中草药等所诱发的肝损伤，严重可致急性肝衰竭，甚至死亡［1］。中药何首乌（polygonum multiflorum thunb，PM）在临床治疗和保健用品中广泛使用，但近年来有关何首乌致肝毒性的病例在国内外均有报道［2-3］。随着药物基因组学的发展，越来越多的研究结果显示HLA基因与何首乌治疗具有相关性，例如Li 等［4］报道了HLA-B*35：01 等位基因是引起PM-DILI 的危险因素，可以作为预测PM-DILI 的潜在生物学标志物。2021年，黄德良等［5］进一步验证了HLA-B*35：01 等位基因可能是何首乌导致药物性肝损伤的分子标志物。因此，我国发布的《何首乌安全用药指南》［6］在何首乌肝损伤的风险防控与建议中提出，对于携带HLA-B*35：01 等位基因生物学标志物的患者，建议避免使用何首乌。

本研究对山东省各地市造血干细胞捐献的汉族志愿者HLA-B*35：01 等位基因的携带率和基因频率进行分布调查，同时通过文献和资料检索了中国部分省市汉族人群中HLA-B*35：01 等位基因的分布，了解作为何首乌肝损伤分子标志物的HLA-B*35：01 等位基因在中国汉族人群中的分布情况和地区差异，以期为在使用何首乌治疗相应疾病前，是否需要进行基因筛查以免发生不良后果及安全用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 山东人群数据检索与提取 收集山东省骨髓库2007 至2021 年入库且具有HLA-B 位点高分辨数据的志愿者22 661 人作为研究对象，志愿者入库年龄为18～45 岁，其中男12 808 例，女9 853 例，符合造血干细胞捐献者健康征询要求，均为汉族且无亲缘关系，根据知情同意原则，均签订《中国造血干细胞捐献者资料库志愿捐献者同意书》。采集静脉血5 mL 于EDTA-K2抗凝管中，按照EZBeadTM全血DNA 提取试剂盒（批号：M314032，美国TBG 公司）及EZBead DNA 提取工作站（美国TBG 公司）说明书进行全血基因组DNA 提取，样本置于-20 ℃保存。

取200 μL DNA 标本，采用PCR-序列特异的寡核苷酸探针杂交（sequence specific oligo-nucleotide probe，SSOP）法，使用LABTypeSSO 试剂盒（B位点批号：X1BR001，美国One Lambda 公司）及ABI 9700 型PCR 扩增仪（美国ABI 公司）对DNA标本HLA-B 位点进行PCR 扩增。PCR 扩增条件：96 ℃3 min；96 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃20 s，5 个循环；96 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃20 s，30 个循环；72 ℃10 min，4 ℃保存。PCR 扩增产物经Luminex100 型流式杂交仪（美国Luminex 公司）杂交和荧光标记后，采用FLEXMAP-3D 多功能流式点阵仪（美国Luminex 公司）进行HLA-B 高分辨等位基因分型，结果由HLA Fusion 软件（美国One Lambda公司）根据阳性反应探针自动判读。试验操作严格按照试剂盒及仪器说明书进行。

HLA-B 位点数据以*后4 位为准。按照中华骨髓库志愿者所在地区进行分组，得到济南、菏泽、德州、潍坊、济宁、泰安、临沂、东营、滨州、枣庄、日照、莱芜、聊城等13 个组。

1.2 我国其他省市HLA-B*35：01 等位基因的数据检索 使用检索式（HLA）and（high-resolution or frequencies）and（allele or haplotype）and（Chinese or China）在PubMed 数据库中检索英文文献，使用检索式“HLA”and“高分辨”and“等位基因”在中国知网数据库检索中文文献，并结合HLA 频率数据库（http：／ ／www.allelefrequencies.net）检索中国其他各省市汉族人群HLA-B*35：01 等位基因分布的数据。

1.3 统计学分析 采用Micosoft excel 2010 软件进行统计学处理，HLA-B*35：01 等位基因携带率＝携带标本数／标本总数×100%；HLA-B*35：01 等位基因频率＝等位基因数／（2×标本总数）×100%，分析方法为一般频数分布。采用Micosoft excel 2010软件对HLA-B*35：01 等位基因进行哈温（HWE）平衡计算。

2 结果

2.1 山东人群HLA-B*35：01 等位基因的携带率、基因频率及哈温平衡检测结果 纳入本次研究的山东汉族人群中，具有HLA-B 位点高分辨数据的样本为22 661 例，其中携带HLA-B*35：01 基因者1 360例，纯合携带者16 例，其等位基因携带率为6.0%；等位基因频率为3.0%。HLA-B*35：01 等位基因携带率最高的2 个城市分别为滨州（6.68%）和聊城（6.65%），等位携带率最低的2 个城市分别为枣庄（3.76%）和日照（4.67%）。哈温平衡检测结果显示，HLA-B*35：01 等位基因在山东各个地区中的分布符合哈温平衡（P＞0.05），见表1。

表1 山东地区汉族人群HLA-B*35：01 等位基因携带率和等位基因频率

2.2 中国其他省市汉族人群HLA-B*35：01 等位基因携带率及基因频率 检索中国其他省市汉族人群的文献，如有多篇报道同一地区的文献，以样本量多的文献为参考数据，纳入研究中国部分省市中，上海、云南、湖北、浙江、重庆、江苏、广州、南宁、中国香港和中国台湾归类于中国南方地区，河南、陕西、辽宁、安徽、京津冀地区、黑龙江归类于中国北方地区，其HLA-B*35：01 等位基因携带率和等位基因频率数据见表2。

表2 中国其他省市汉族人群HLA-B*35：01 等位基因携带率和等位基因频率

3 讨论

PM-DILI 是一种不可预测的、与剂量无关的迟发性药物不良反应［22-23］，这种迟发性药物不良反应可能是由T 细胞的不适当激活引起的。HLA 分子被认为是主要激活T 细胞的关键蛋白［24-25］，因此，HLA基因多态性可能是导致DILI 的高风险因素［26-27］。Li 等［4］通过研究将HLA-B*35：01 确定为PM-DILI 的潜在遗传高危因素，揭示了HLA-B*35：01作为一种生物学标志物可能具有潜在的临床价值。黄德良等［5］研究发现，所有确诊何首乌导致药物性肝损伤的患者均携带HLA-B*35：01 等位基因，进一步证实何首乌诱导肝损伤与HLA-B*35：01 等位基因存在相关性。

本研究中，纳入研究的山东地区汉族人群中携带HLA-B*35：01 等位基因的有1 360 例，其等位基因携带率为6.0%，等位基因频率为3.0%。此外，泰安（6.64%）、莱芜（6.27%）、临沂（6.06%）和济南（6.57%）的携带率均超过了全省（6%）平均值。中国常见及确认的HLA 等位基因表（Common alleles and well documented alleles，CWD）（2.3 版）显示，在中国人群中，HLA-B*35：01 的等位基因频率为2.47%，等位基因携带率约为4.9%。相比之下，山东汉族人群HLA-B*35：01 的等位基因频率高于全国平均比例，携带率较低的日照也达到了4.67%，接近全国4.9%的均值。Allele*Frequencies数据库（http：／ ／www.allelefrequencies.net／hla.asp）和文献检索数据显示，HLA-B*35：01 等位基因在湖北汉族［14］、江苏汉族［18］、浙江汉族［16］、安徽汉族［10］、广西南宁汉族［21］、重庆汉族［17］、上海汉族［11］、广州汉族［20］、云南汉族［12］以及中国香港［19］和中国台湾［15］等南方人群的携带率分别约为5.12%、4.72%、4.88%、6.2%、1.42%、4.74%、6%、2.96%、6%、3.76%和4.96%，而河南汉族［7］、辽宁汉族［16］、黑龙江汉族［13］、陕西汉族［8］和京津冀地区等北方人群的携带率分别为7.3%、6.64%、5.4%、7.34%和6%。南方人群中除湖北、上海、云南和安徽人群外，其余均低于或接近于全国平均4.9%的携带率，而北方人群中均高于全国4.9%的均值。可以看出HLA-B*35：01 等位基因在北方的分布高于南方，提示中国人群HLA基因分布具有明显的地域性。

从以上数据来看，为了避免药物性肝损伤的发生，中国北方人群对在使用何首乌及其相关制剂时开展HLA-B*35：01 等位基因筛查的迫切性高于南方人群。本研究中对山东地区汉族人群进行了较为细致的划分，发现省内不同地市之间也存在频率分布的差异，济南、泰安、聊城、滨州等地HLA-B*35：01等位基因携带率较高，可以尝试性开展用药前基因筛查。

本研究通过对PM-DILI 分子标志物HLA-B*35：01等位基因在中国部分省市汉族人群中进行分布调查，揭示了该等位基因在中国不同地区的分布特点，能够了解不同地区人群的基因分布特征，为在使用何首乌之前是否进行HLA 基因分型筛查提供科学依据和数据支持，对于避免PM-DILI 的发生，倡导安全用药有着重要的影响与意义。地处经济发达、医疗条件良好地区，特别是所在省份的省会城市，可以尝试性的在一定范围内进行用药前的基因筛查，结合临床病例分析，为是否适合大范围推广筛查提供可靠的临床数据。本研究尚存在诸多不足之处，例如因数据库检索权限和使用的限制，加之文献数据并没有概括所有人群，本研究并未包括中国全部地区和民族的人群数据，无法作出更为全面细致的分析。此外，对于专门针对HLA-B*35：01基因检测试剂盒的研发以及开展基因检测的成本效益分析也将是笔者后期需进行的研究内容，为临床检测降低检测成本和精准用药提供更为科学准确的数据支持。