羔羊粪便中产酸克雷伯菌的分离鉴定及药敏试验

李仕林，吐努克·巴合提别克，王德超，巴合提别克·库尔班，焦海宏

（ 1.特克斯县畜牧兽医发展中心，新疆 伊犁 835500 ；2.塔里木大学动物科学学院，新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300 ）

克雷伯氏菌属（K. lebsiella）目前可分为6种，分别为产酸克雷伯菌（K. oxytoca）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、植生克雷伯菌（K. planticola）、土生克雷伯菌（K. terrigena）和活动克雷伯菌（K. mobilis）[1]。克雷伯菌在大型奶牛场患临床乳房炎病例中的分离率为13.0%，仅次于大肠杆菌（14.4%）[2]。其中产酸克雷伯菌具有较强的内毒素释放能力[3]，为革兰氏阴性菌，是主要的条件致病菌，存在于人和动物的肠道，可导致人畜患病[4]，引起肝脓肿、腹膜炎、肠炎、腹泻[5]。

随着养殖业规模不断扩大，由产酸克雷伯菌引起动物发病的概率大大增加，给养殖业造成了较大的经济损失。本研究通过采集腹泻羔羊粪便，进行细菌分离培养、生化鉴定、16S rRNA基因扩增测序、药敏试验、中药体外抑菌试验等，旨在为预防治疗由克雷伯菌引起的动物疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集

样品为从新疆南疆策勒县某规模化羊场无菌采集两周龄内腹泻羔羊的粪便75份，于实验室4 ℃冰箱保存。

1.1.2 试验动物

试验小鼠均由塔里木大学动物科学学院兽医系动物实验站提供。

1.1.3 主要试剂

麦康凯琼脂（MAC）培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）培养基均购自杭州生物试剂有限公司，LB肉汤琼脂培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司，脑心浸液琼脂（BHI）培养基购自碧迪医疗器械（上海）有限公司，5%绵羊血清由塔里木大学动物实验站提供，革兰氏染色试剂购自上海源叶生物科技有限公司。

肠道菌科细菌生化鉴定管购自杭州生物试剂有限公司，细菌16S rRNA的PCR扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，2×Power Taq PCR MasterMix购自北京百泰克生物技术有限公司，细菌基因DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

麦氏比浊管购自常德比克曼生物科技有限公司，药敏纸片购自杭州生物试剂有限公司，甘草、艾叶购自新疆阿拉尔市郭森中药房。

1.1.4 主要仪器

BL-75A型立式压力蒸汽灭菌气筒（上海东亚压力容器制造有限公司）、101型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司）、CJ-2DF净化工作台（上海康路仪器设备有限公司）、XM4008隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、E200生物显微镜（上海巴拓仪器有限公司）、ZWY-240台式恒温摇床（上海智城仪器有限公司）、H-1650-W台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、DK-80数显恒温水浴锅（常州高德仪器制造有限公司）等。

1.2 试验方法

1.2.1 分离培养

无菌采集样品同时接种于MAC培养基、EMB培养基37 ℃恒温培养18～24 h培养，观察菌落形态特征，将疑似菌株接种于LB固体培养基37 ℃恒温培养18～24 h纯化培养；挑取单菌落接种于LB液体培养基，37 ℃恒温培养18～24 h；将菌液进一步接种于绵羊血平板，37 ℃恒温培养18～24 h，观察其形态结构。

1.2.2 革兰染色镜检

挑取MAC培养基单个疑似菌落进行革兰染色镜检。

1.2.3 生化试验

将上述细菌纯化物分别接种于生化试验微量发酵管中37 ℃恒温培养18～24 h，按照生化管说明书添加不同试剂，根据《常见细菌系统鉴定手册》判定试验结果。

1.2.4 16S rRNA基因扩增

根据细菌DNA提取试剂盒说明书，提取菌体DNA，进行16S rRNA基因扩增，目的片段大小1 500 bp左右。引物序列为：1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT；27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。

反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将测序结果在NCBI数据库进行BLAST比对，得到的产酸克雷伯菌进行排序编号。

1.2.5 致病性试验

将纯化的分离株接种于LB液体培养基，37 ℃恒温培养18～24 h得到菌液。挑选30只体重15～20 g的小鼠，随机分为6组，每组5只。第1～第5组为试验组，第6组为对照组。各试验组小鼠分别腹腔注射5株分离菌株的菌液0.3 mL/只，对照组小鼠腹腔注射无菌生理盐水0.3 mL/只，正常饲喂12 h，观察结果。若出现小鼠死亡则进行剖解，无菌采取心、肝，取适量心肝渗出液接种于MAC培养基，37 ℃恒温培养18～24 h，观察菌落特征并进一步染色镜检。

1.2.6 药敏试验

取1.2.5中适量已纯化菌液，用生理盐水稀释至菌液浓度为1.5×108CFU/mL（0.5麦氏比浊管），无菌棉签蘸取少量稀释菌液均匀涂布于BHI琼脂培养基，将20种药敏片均匀贴于培养基表面，37 ℃培养18～24 h，观察结果并测量抑菌圈大小。

1.2.7 中药体外抑菌试验

采用水煮法制备药液，称取甘草、艾叶各20 g，组成方剂。加入8～10倍纯净水浸泡24 h后，先用大火煎沸，后改用小火煎煮。第1次煎煮30～60 min，过滤药液；第2次加入5倍纯净水煎煮30 min，过滤药液；合并两次滤液，煎煮至药液终浓度为1 g/mL，3 000 r/min离心取上清，121 ℃高压灭菌，4 ℃保存。

制备BHI琼脂培养基，取1.2.5中适量已纯化菌液分别均匀涂布于培养基表面，打孔器高温杀菌，在培养基上打孔，火焰封底。一孔加入40 μL蒸馏水作为对照，其余3孔添加入相同的药液40 μL，药液终浓度为1 g/mL。37 ℃恒温培养18～24 h，观察结果。使用游标卡尺测量抑菌圈大小，并作记录；抑菌效果评价方式参考卢宇[6]的研究：抑菌圈直径（d）≥20 mm为极敏，20 mm＞d≥15 mm为高敏，15 mm＞d≥10 mm为中敏，10 mm＞d＞6 mm为低敏，d≤6 mm为无抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养结果（见图1～图3）

图1 分离株在MAC培养基上的特征Fig.1 Characterization of isolates on MAC medium

从新疆某规模化羊场无菌采集样本75份，共分离出10株疑似产酸克雷伯菌。疑似菌株在MAC培养基上形成粉红色黏稠菌落（见图1）；在EMB培养基上形成较大、黏稠、易融合成一片的粉红色菌落（见图2）；绵羊血平板上形成较大、凸起、白色黏液状的菌落，用接种环蘸取少许菌落可拉成线丝（见图3），LB液体培养基上生长数日可形成黏稠液体。

图2 分离株在MBC培养基上的特征Fig.2 Characterization of isolates on MBC medium

图3 分离株在绵羊血平板培养基上的特征Fig.3 Characterization of isolates on sheep blood plate culture-medium

2.2 分离株革兰染色镜检结果（见图4）

图4 分离株革兰染色镜检结果Fig.4 Results of gram staining microscopy of isolates

由图4可知，分离株革兰染色镜检呈阴性粗短的直杆菌，呈单个、成对或短链状排列。

2.3 生化试验结果（见表1）

表1 生化试验结果Tab.1 Identification results of biochemical tests

由表1可知，分离株分解葡萄糖，产酸产气；利用枸橼酸盐；赖氨酸反应阳性；鸟氨酸脱氢酶反应阴性；甲基红阴性；靛基质反应阳性。理化特性参考《常见细菌系统鉴定手册》[7]，表明分离菌与产酸克雷伯菌常规生化反应相符。

2.4 16S rRNA基因扩增与测序

10株分离株经扩增得到长度为1 500 bp的条带，与预期相符，结果见图5。

图5 分离株16S rRNA电泳结果Fig.5 Results of 16S rRNA electrophoresis of isolates

将已纯化的PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果在NCBI数据库进行BLAST对照，结果显示，分离菌与产酸克雷伯菌SHO-1菌株（登录号：GU361112.1）、产酸克雷伯菌SB3051菌株（登录号：AJ871863.1）相似度大于98%，表明本研究共鉴定出5株产酸克雷伯菌，编号为1～5号菌株。

2.5 致病性试验结果（见表2）

表2 致病性试验结果Tab.2 Pathogenicity test results

由表2可知，第1～第4组小白鼠全部死亡，死亡小鼠无腹泻现象。第5组小白鼠生长良好，对照组（第6组）小白鼠生长良好。结果表明，所分离的5株产酸克雷伯菌中1～4号菌株具有致病性。

死亡小白鼠解剖无菌采集肺、肝接种于MAC培养基，37 ℃恒温培养18～24 h，挑取菌落染色镜检呈短链或成对球形，与上述镜检形态一致。

2.6 药敏试验结果（见表3）

表3 药敏试验结果Tab.3 Results of drug sensitivity test

由表3可知，产酸克雷伯菌对米诺环素、多西环素、四环素、庆大霉素、头孢哌酮、丁胺卡那、头孢曲松、呋喃唑酮、复方新诺明、氯霉素、环丙沙星、氧氟沙星高度敏感，对多黏菌素B中度敏感，对红霉素、新霉素、卡那霉素、克林霉素、诺氟沙星、麦迪霉素、万古霉素低度敏感或耐药。

2.7 中药体外抑菌试验结果（见表4）

表4 中药体外抑菌试验结果Tab.4 Antibacterial test results of traditional Chinese medicine in vitro 单位：mm

由表4可知，甘草、艾叶组成的方剂对5株产酸克雷伯菌均产生了抑菌效果，且对不同菌株抑菌效果有所不同。

3 讨论

产酸克雷伯菌属于条件致病菌，曾经从植物及水生环境中检出，也存在于人和动物肠道内，可导致人畜患病。本试验从腹泻羔羊粪便中分离出10株具有产酸克雷伯菌特征的细菌，经PCR测序得到5株产酸克雷伯菌，之后进一步进行了药敏试验及中药体外抑菌试验。药敏试验结果表明，试验分离的产酸克雷伯菌对米诺环素、多西环素、四环素、庆大霉素、头孢哌酮、丁胺卡那、头孢曲松、呋喃唑酮、复方新诺明、氯霉素、环丙沙星、氧氟沙星高度敏感，对多黏菌素B中度敏感，对万古霉素等药物低度敏感或耐药，这与曾家琼等[9]研究的结果一致，可能是研究中的产酸克雷伯菌均分离自动物粪便。李月等[10]研究表明，产酸克雷伯菌对头孢曲松、庆大霉素、四环素、氯霉素、复方新诺明、氧氟沙星、环丙沙星耐药，与本试验结果差异显著。出现这种差异的原因可能是：李月等[10]研究中的猪场病原混合感染严重，大量不合理使用抗生素，导致抗生素耐药性增强以及猪场疾病复杂多样；病原未明确，导致无法合理筛选抗菌药；且李月等[10]研究中的菌株为猪源性，而本研究所分离菌株来自羔羊，具有一定种属差异。

目前抗生素价格相对低廉、使用方便，但生产过程中由于抗生素滥用导致细菌对抗生素产生了耐药性[11]，已经成为动物疫病防控治疗中的难题，动物疫病防控面临巨大挑战。中草药作为中国传统药材，来源广泛，资源丰富，毒副作用低，使用方便，同时具有抗菌、抗病毒、免疫调节、提高生产性能的功效[12]。本试验根据绵羊采食草料特性，选用绵羊可采食中草药（甘草、艾叶）进行体外抑菌试验。本试验结果表明，由甘草和艾叶组成的方剂对试验分离的5株产酸克雷伯菌产生了抑菌作用。艾叶抑菌成分为挥发油、黄酮，甘草的主要抑菌成分包括甘草黄酮、甘草查尔酮、甘草酸等，这与张召兴等[13]研究中甘草素、甘草查尔酮A为甘草中主要抑菌成分的结果相符。王华等[14]研究表明，艾叶水提液对葡萄球菌、大肠杆菌等菌均具有抑制作用。甘草酸能够抑制变形链球菌生长、产酸、黏附及生物膜形成[15]，艾叶的有效成分艾叶挥发油对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌均具有抑菌作用[16]。上述文献也证实了甘草和艾叶具有一定的抑菌效果。

4 结论

本试验从南疆规模化羊场共采集腹泻羔羊粪便75份，经细菌分类培养、PCR鉴定共得到5株产酸克雷伯菌，且具有一定的致病性。药敏试验结果表明，产酸克雷伯菌对米诺环素、多西环素、四环素、庆大霉素、头孢哌酮、丁胺卡那、头孢曲松、呋喃唑酮、复方新诺明、氯霉素、环丙沙星、氧氟沙星高度敏感，对多黏菌素B中度敏感，对红霉素、新霉素、卡那霉素、克林霉素、诺氟沙星、麦迪霉素、万古霉素低度敏感或耐药。中药体外抑菌试验结果表明，甘草、艾叶组成的方剂对本研究分离的产酸克雷伯菌产生了一定抑菌效果。