不同梯度微生物菌剂对青花鸡粪发酵的影响

2023-10-11苏杭谭港高珩邵刘子湲赵倩吴玉苏金全王绍卿

现代畜牧兽医 2023年9期

苏杭，谭港，高珩邵，刘子湲，赵倩，吴玉，苏金全，王绍卿*

（ 1.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201 ；2.剑川县老君山青花鸡产业发展有限责任公司，云南大理 671000 ）

滇西地区山多平地少，规模化养殖场如何处理大量畜禽粪便成为亟待解决的问题。传统做法是将大量新鲜粪便直接在平地晾晒之后装袋贩卖，这一做法不但浪费土地资源，也成了春夏季节苍蝇蚊虫的重要来源，不仅影响养殖场环境，且极易造成疾病传播。将畜禽粪便进行生物热堆肥是解决处理大量畜禽粪便问题的根本途径。具体做法是在原有微生物的基础上加入活性强、繁殖速度快的微生物，有利于加快堆肥进程，同时将原本粪便中不易利用的粗蛋白转化为菌体蛋白，从而被其他生物利用。将畜禽粪便进行无害化处理后的可再生利用，不但可最大化利用土地资源，还能够保氮除臭，减少病原微生物，作为饲料、肥料应用均具有很好的经济效益。青花鸡作为滇西地区大理州剑川县独有品种，仅分布于云南少数民族聚集地，具有体格适中、肉质风味好、抗病力强、适应性好、外观独特等优点。本试验选用市售微生物菌剂产品，在青花鸡雏鸡粪添加3%、4%、5%等3个梯度的菌液进行发酵试验，并检测不同梯度样品的发酵效果，以期为滇西特色畜禽品种青花鸡粪的可再生利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鸡粪收集自剑川县老君山青花鸡产业发展有限责任公司的非用药期笼养雏鸡（0～21日龄），经过晒干粉碎处理，共30 kg。雏鸡根据《鸡的饲养标准》（1986）及参照美国NRC饲养标准配制日粮，按常规方法进行免疫接种，自由采食和饮水。

试验菌液选择市售产品“给它”EM菌液（由佛山市南海禅泰动物药业有限公司生产），主要成分包括枯草芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌、酵母菌、酶等。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒离心柱型（北京天根生化科技有限公司），DNA Marker、Biosharp BL631A 2×Taq PCR MasterMix for PAGE（含染料）、Biosharp BS081-100g琼脂糖Agarose、TSINGKE TSMD011 LB Lennox培养基干粉、1×TAE速溶颗粒（北京擎科生物科技有限公司），沙门氏菌、志贺菌属琼脂培养基（SS培养基）、麦康凯琼脂（杭州百思生物技术有限公司）。

主要仪器：SKD-1000全自动凯氏定氮仪（上海沛欧分析仪器有限公司）、PHS-3C pH计（上海仪电可约仪器股份有限公司）、SHA-B恒温振荡器（常州智博瑞仪器制造有限公司）、JK9830自动凯氏定氮仪（济南精密科学仪器仪表有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海龙跃仪器设备有限公司）、旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、JJ-CJJ-1FD洁净工作台（苏州市金净净化设备科技有限公司）、迷你高速离心机（湖南可成仪器设备有限公司）、LBI-80生化培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司）、T100梯度PCR仪（Bio-Rad Laboratories）、ZD-85恒温振荡箱（常州智博瑞仪器制造有限公司）、手提式高压蒸汽灭菌锅（上海力辰仪器科技有限公司）、1600全自动数码凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司）。

1.3 试验设计（见表1）

表1 试验设计Tab.1 Experimental design 单位：kg

设置1个对照组（A组）和3个试验组（经处理后的鸡粪中分别加入3%、4%、5%菌液，即B组、C组、D组），每组两个重复，共8份样品，每份样品为3 kg鸡粪。将处理好的鸡粪与菌种搅拌、混匀，加水至用手握鸡粪成团，松手即散为止（预试验测得水分含量为40%）。各组分别装入塑料容器，装满压实，排去空气后覆盖塑料薄膜，盖上盖子密封。试验期90 d[1]。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 感官鉴定

发酵后检测鸡粪饲料的颜色、气味和质地，评定标准参考文献[2-3]。

1.4.2 理化鉴定

采用水分测定法（GB/T 6435—2014）测定发酵后样品水分含量，凯氏定氮法（GB/T 6432—2018）测定粗蛋白含量。采用精密pH计测定pH值，温度计测定样品温度。

1.4.3 病原微生物

1.4.3.1 细菌鉴定

（1）细菌培养与菌落形态观察。

发酵试验结束后，每个重复取1 g粪便和9 g生理盐水混匀，制成浓度为10-1的菌液，从中取出1 g稀释10倍，制成浓度为10-2的菌液，以此类推，最终制成浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4的样品菌液。取200 μL悬液均匀涂布到已凝固的麦康凯、SS培养基上，将接种好的培养基置于37 ℃的培养箱中培养48 h。观察菌落形态，参考《伯杰细菌鉴定手册》筛选麦康凯、SS培养基中生长菌落形态是否与大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌特征相符。

（2）分子生物学鉴定。

选取上一步骤中筛选出的6份可疑菌落接种于1.5 mL LB液体培养基，摇床振荡培养7 h。参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒离心柱型说明书提取DNA，选用通用引物16S rDNA进行PCR反应。引物序列见表2。

表2 通用引物序列Tab.2 Universal primer sequence

PCR反应体系（25 μL）：模板1 μL、引物上下游各0.5 μL、水10.5 μL、Mix 12.5 μL。

PCR反应条件：94 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，34次循环；72 ℃10 min，4 ℃降温。进行琼脂糖凝胶电泳，产物送至生工生物工程股份有限公司测序，测序结果在NCBI BLAST上进行同源性分析。

（3）菌落计数。

根据前两个步骤的结果，以麦康凯、SS培养基上生长的红色菌落作为大肠杆菌（Escherichia coli）计数，检测大肠杆菌菌落数量[4]；麦康凯培养基上生长的无色菌落、SS培养基上生长的无色或中心为黑色的菌落作为沙门氏菌（Salmonella）计数，检测沙门氏菌菌落数量[5]；SS培养基上生长的无色半透明小菌落作为志贺氏菌（Shigella）计数，检测志贺氏菌菌落数量[6]。

1.4.3.2 寄生虫鉴定

参照饱和食盐水漂浮法鉴定粪便样品中是否存在鸡蛔虫虫卵与鸡球虫虫卵。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用Excel软件进行统计，SPSS 23软件进行单因素方差分析，LSD法、邓尼特T3法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 感官测定结果（见表3）

表3 感官测定结果Tab.3 Sensory test results

由表3可知，D组样品发酵程度最高，发酵完成时具有较浓酸香味且略带酒香味、质地柔软蓬松且呈较深棕黑色；B组、C组发酵完成时均具有较淡酸香味、质地柔软松散且呈棕黑色；A组仍有粪臭味、干燥结块且呈棕灰色，即表明未发酵。

2.2 理化鉴定结果（见表4）

表4 理化鉴定结果Tab.4 Physical and chemical identification results

由表4可知，B组、C组发酵完成后水分含量显著高于A组（P＜0.05），D组发酵完成后水分含量极显著高于A组（P＜0.01）；D组发酵完成后温度极显著高于A组（P＜0.01）；B组、D组发酵完成后pH值极显著高于A组（P＜0.01），C组显著高于A组（P＜0.05）；各组发酵完成后粗蛋白含量差异均不显著（P＞0.05）。理化鉴定结果显示，B组、C组、D组样品均达到发酵完成标准。

2.3 病原微生物检测

2.3.1 菌种鉴定

选择6份符合大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌菌落形态的可疑菌株（见图1）进行PCR反应，结果见图2。

图1 可疑菌落形态Fig.1 Suspicious colony morphology

图2 可疑菌落电泳结果Fig.2 Suspicious colony electrophoresis results

由图2可知，6份可疑菌株经PCR电泳均得到1 540 bp的条带，结果符合预期。

将回收产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在NCBI BLAST上进行同源性分析，结果显示，1号样品与志贺氏菌同源性达98.33%，2号样品与大肠杆菌同源性达99.29%，3号样品与大肠杆菌同源性达99.03%，4号样品与海氏肠球菌同源性达94.48%，5号样品与大肠杆菌同源性达99.39%，6号样品与大肠杆菌同源性达99.04%。根据PCR电泳结果，参考符合志贺氏菌菌落形态和符合大肠杆菌菌落形态（见图3），采用平板计数法统计样本中符合大肠杆菌、志贺氏菌菌落形态的菌落数量，结果见表5。

图3 符合描述的大肠杆菌与志贺氏菌菌落形态Fig.3 Morphology of Escherichia coli and Shigella according to the description

表5 样品发酵后菌落数量Tab.5 Statistical table of colony number 单位：个/mL

由表5可知，D组样品中大肠杆菌数量比A组下降了4个数量级，C组、D组样品均未培养出志贺氏菌。综上所述，D组的发酵效果最好。

2.3.2 寄生虫鉴定结果（见图4）

图4 寄生虫鉴定结果Fig.4 Parasitic identification result

由图4可知，各组样品镜检寄生虫结果均为阴性。

3 讨论

本研究结果显示，不同梯度的微生物菌剂均能够促进鸡粪发酵过程，D组发酵效果最好，该梯度样品发酵完成后带有酸香味、酒香味，质地松软均匀，颜色为较深的棕黑色，水分增多，温度升高，pH值处于5.5～8.5，这与李尚民等[7]的研究结果相同。本试验中样品发酵完成后的温度低于李尚民等[7]、张玉凤等[8]试验温度，原因可能是本研究中的发酵试验时值冬春交替，且位于高海拔山区，故发酵完成时温度较低，所需时间也较长。因此，可根据畜禽粪便堆肥过程中不同温度下的优势菌种，选择适用于滇西片区畜禽粪便发酵的微生物。如Jiang等[9]分离出的一种适用于中国寒冷地区畜禽粪便高效性低温发酵的嗜冷真菌，不但能够快速降解纤维素也可用于低温发酵，极其适用于高海拔山区的畜禽粪便发酵。何凌[10]研究发现，以1∶1∶1比例混合米曲霉、酿酒酵母、白地霉混合发酵鸭粪产生菌体蛋白的产量最高，这一研究结果提示可将发酵畜禽粪便作为有机肥料，促进畜禽粪便的可再生利用。

本试验中，发酵完成后，D组样品中的大肠杆菌数相比A组下降了63.59%～76.82%，且未检出志贺氏菌，这与刘小飞[2]、张玉凤等[8]的结果相同。原因可能是本试验选择的青花鸡养殖场未流行伤寒、副伤寒等禽沙门氏菌病[11]，但部分雏鸡出现轻微腹泻，存在选取的6份可疑菌落未包含沙门氏菌的可能。本研究中，分离自A组样品的1号可疑菌株可能为福氏或宋内氏志贺氏菌。经调查发现，样本来源的部分7～14日龄雏鸡发生不严重的腹泻[12]。因此，后续可进一步开展试验，重新对该养殖场采样并设计特异性引物，结合生化试验、药敏试验、血清学试验等方法[13]分离鉴定分离自青花鸡粪的鸡源性志贺氏菌，对滇西片区云南地方鸡种志贺氏菌病防治具有重要意义。

养殖过程中结合临床症状发现，有个别青花鸡出现关节肿胀、咳嗽、啰音、腹泻、产软壳蛋等禽大肠杆菌病症状[14]，但也可能为多种病原体混合感染或营养代谢病等，可采用黄芩散、芩柏龙胆散、抗生素等进行防治[15]。近年来，临床常采用噬菌体治疗禽大肠杆菌病及沙门氏菌，Pantoja-Don等[16]、Kittler等[17]研究发现，噬菌体可改善肠道菌群，减少疾病发生并提高机体免疫力。Maslov等[18]的噬菌体“杀死胜利者假说”也促进了噬菌体应用于畜禽粪便发酵过程的相关研究。本研究中，各组样品镜检均未检出鸡球虫、鸡蛔虫的虫卵，原因可能是发酵前青花鸡雏鸡粪经晒干粉碎处理导致虫卵死亡，且试验所选为笼养雏鸡，粪便中无鸡蛔虫、鸡球虫感染。但结合临床症状及病理剖检结果可知，个别散养青花鸡肠道内存在寄生虫虫体，应进一步确定虫种再进行治疗。