加味理中汤方对脾虚泄泻小鼠血常规、血糖及脏器指数的影响

2023-10-11郝洪丹刘冠慧张议心尚佳静罗娟

现代畜牧兽医 2023年9期

郝洪丹，刘冠慧，张议心，尚佳静，罗娟

（河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038 ）

腹泻是常见的动物消化系统疾病。腹泻病属于中医“泄泻”范畴，以排便次数增加为主要症状，大便呈溏薄状或水状[1]。泄泻证型不同治疗方法也不同，但临床中通常不辨证，普遍只给予抗生素治疗。目前，随着抗生素的广泛应用，其引起的耐药情况在全球范围内已十分普遍，且兽用抗生素滥用问题也日渐凸显[2]。抗生素过度使用会造成肠道菌群失调，使免疫系统和代谢紊乱，引起慢性腹泻、抗生素耐药及其他临床并发症[3-4]。中药具有耐药性低、多靶点、天然低毒等治疗特点，可用于代替抗生素治疗人类和动物各种疾病。已有研究表明，中药对于肠激惹综合征、溃疡性结肠炎、慢性腹泻等多种病因引起的腹泻[5-9]均具有很好的疗效。

张景岳主张泄泻病位在脾胃，呈现脾虚邪实[10]，脾虚和湿邪是主因。畜禽临床中，由于饲养不当、营养过剩导致脾胃亏虚，且多食寒凉，脾虚寒湿泄泻证常见。《伤寒论》中的理中汤是治疗脾胃虚寒的代表方剂。为更好地治疗泄泻造成的津伤气虚及腹痛，本研究针对脾虚寒湿泄泻，在理中汤中加入茯苓、山药，加强祛湿作用兼而保护津液；加木香、桂枝、砂仁增加行气止痛和助阳止泻的功效。番泻叶为苦寒之品，是建立脾虚泄泻模型常用的苦寒泻下法药物[11-12]。本试验通过建立脾虚泄泻小鼠，研究理中汤加减对其血常规、血糖及脏器指数等指标的影响，为后续理中汤加减应用于兽医临床治疗腹泻提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

无特定病原体级ICR小鼠72只，体重（20±2） g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2019-0010。动物饲养于河北工程大学动物房，雌、雄分笼饲养，在适宜的饲养环境下（室温约22 ℃，相对湿度为50%～70%，室内清洁且安静），光照12 h、黑暗12 h交替进行，自由采食标准饲粮及饮用纯净水，每日清理鼠笼1次。

1.2 试剂与仪器

本研究所用中药均购自北京同仁堂邯郸药店，包括干姜（批号：22051101）、党参（批号：391210701）、白术（批号：117220601）、茯苓（批号：325220701）、山药（批号：220622002）、木香（批号：211017005）、桂枝（批号：261220701）、砂仁（批号：348200701）、甘草（批号：27220802）。恩诺沙星片（KVP Kiel有限责任公司，生产批号：KV03CRF）。

主要仪器：FA1104电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、XFH-75CA高压灭菌锅（浙江新丰医疗器械有限公司）、DHG-9070A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、BC-2800自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）、BCD-182LTMPA冰箱（青岛海尔生物医疗股份有限公司）、582血糖仪（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司）。

1.3 试验用药物制备

1.3.1 恩诺沙星溶液的制备

取恩诺沙星片50 mg加入灭菌蒸馏水41.41 mL中，配制成浓度为1.21 g/L的溶液，4 ℃冰箱保存。

1.3.2 中药复方提取物的制备

取中药干姜15 g、党参15 g、白术15 g、茯苓15 g、山药20 g、木香5 g、桂枝5 g、砂仁5 g、甘草5 g（生药量为100 g）。中药加蒸馏水1 L，浸泡1 h后煎煮30 min，使用12层纱布过滤；药渣加蒸馏水0.5 L再煎煮20 min，再次使用12层纱布过滤。两次滤液合并后加热蒸发浓缩至50 mL（按生药计2 g/mL），冷却至室温后分装5份，每份10 mL，高压灭菌后4 ℃冰箱保存。

1.4 加味理中汤方对脾虚泄泻小鼠血常规、血糖及脏器指数的影响

1.4.1 试验设计

无特定病原体级ICR小鼠72只，适应性饲养3 d，试验前一晚禁食不禁水12 h后称空腹体重，根据体重将小鼠随机分为6组，即空白对照组（C组）、泄泻模型组（M组）、恩诺沙星治疗组（A组）、中药低剂量组（ZL组）、中药中剂量组（ZM组）、中药高剂量组（ZH组），每组12只小鼠，雌、雄各半。除C组外，其余各组小鼠按照30 g/kg灌胃番泻叶提取物，C组小鼠灌胃同体积的生理盐水，均每日1次，连续9 d，建立脾虚泄泻模型[13-16]。试验第10 d停用番泻叶，前一晚禁食不禁水12 h，A组小鼠按24.15 mg/kg灌胃恩诺沙星水溶液治疗，各中药组分别给予低剂量（6.5 g/kg）、中剂量（13.0 g/kg）、高剂量（26.0 g/kg）灌胃治疗（分别对应正常治疗剂量的0.5倍、1.0倍、2.0倍），C组和M组采用同体积的生理盐水灌胃，均每日1次，连续治疗3 d。

各组末次给药后禁食不禁水12 h，禁水1 h，眼球取血后断颈处死。试验流程见图1。

图1 试验流程Fig.1 Experimental process diagram

1.4.2 测定指标及方法

1.4.2.1 血常规检测

试验结束后，每组随机选取5只小鼠眼球取血1 mL，注入EDTA抗凝管中，混匀后使用全自动血细胞分析仪进行血常规检测[15]。检测指标包括：白细胞数目、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、中性粒细胞百分比、红细胞数目、血红蛋白以及血小板数目。

1.4.2.2 血糖含量

试验第10 d灌胃前和试验最后1 d眼球取血前，每只小鼠尾根静脉采血1滴，使用血糖仪试纸条检测小鼠空腹血糖含量并记录结果。

1.4.2.3 肝脏、肾脏脏器指数

记录试验最后1d眼球取血前的空腹体重，此为治疗末体重。解剖1.4.1中处死的小鼠，摘取肝脏和肾脏，在精密天平中称重，分别计算肝脏指数、肾脏指数。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用IBM SPSS Statistics 25软件进行分析，单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较，LSD法（假定等方差）及塔姆黑尼法（不假定等方差）进行两两比较，卡方检验进行不同性别间验证。结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 加味理中汤方对脾虚泄泻小鼠血常规指标的影响（见表1）

表1 加味理中汤方对脾虚泄泻小鼠血常规指标的影响Tab.1 Effect of Jiawei Lizhong Decoction on blood routine indexes of mice with diarrhea due to spleen deficiency

由表1可知，与C组相比，M组小鼠白细胞数目、中性粒细胞百分比分别升高了171.18%、384.25%（P＜0.01），淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、红细胞数目、血小板数目分别降低了88.25%（P＜0.01）、51.04%（P＞0.05）、8.17%（P＞0.05）、37.58%（P＜0.05）。与M组相比，各组小鼠白细胞数目差异均不显著（P＞0.05）；A组、ZL组、ZM组、ZH组淋巴细胞百分比分别升高了818.81%、662.26%、722.17%、803.47%（P＜0.01），中性粒细胞百分比分别降低84.50%、68.57%、73.99%、83.05%（P＜0.01）；ZH组血小板数目升高85.90%（P＜0.01）。与A组相比，ZL组小鼠淋巴细胞百分比显著降低（P＜0.05），中性粒细胞百分比极显著升高（P＜0.01）；ZH组血小板数目显著升高（P＜0.05）。各组小鼠单核细胞百分比、红细胞数目、血红蛋白等指标差异均不显著（P＞0.05）。结果表明，加味理中汤方可恢复部分脾虚泄泻小鼠血常规异常指标，且ZH组小鼠血小板数目恢复的情况优于A组。

2.2 加味理中汤方对脾虚泄泻小鼠血糖含量的影响（见图2、图3）

图2 各组小鼠治疗前后空腹血糖含量Fig.2 Fasting blood glucose content of mice in each group before and after treatment

图3 各组小鼠治疗前后血糖含量变化量Fig.3 Changes of blood glucose content before and after treatment in each group of mice

由图2可知，治疗前，与C组相比，其余各组小鼠血糖含量显著下降（P＜0.05），但各组间差异不显著（P＞0.05）。治疗后，与C组相比，M组小鼠血糖含量显著下降48.14%（P＜0.05）；与M组相比，A组、ZL组、ZM组和ZH组小鼠血糖含量分别升高了45.14%、55.38%、79.48%、102.55%（P＜0.05）；与A组相比，ZL组、ZM组和ZH组小鼠血糖含量分别升高了7.06%（P＞0.05）、23.66%（P＜0.05）、39.56%（P＜0.05）。治疗后各组小鼠血糖含量由低到高排序为M组＜A组＜ZL组＜ZM组＜C组＜ZH组。

由图3可知，与C组相比，M组小鼠治疗前后血糖含量变化量降低34.72%（P＜0.05）；与M组相比，A组、ZL组、ZM组和ZH组小鼠治疗前后血糖含量变化量分别升高23.42%、27.35%、44.89%、62.65%（P＜0.05）；与A组相比，ZL组、ZM组、ZH组小鼠治疗前后血糖含量变化量分别升高3.93%（P＞0.05）、21.47%（P＜0.05）、39.23%（P＜0.05）。治疗前后各组小鼠血糖含量变化量由低到高排序为M组＜A组＜ZL组＜C组＜ZM组＜ZH组。

结果表明，加味理中汤方可改善脾虚泄泻造成的血糖下降，且ZM组和ZH组效果优于A组。

2.3 加味理中汤方对脾虚泄泻小鼠肝脏指数、肾脏指数的影响（见表2）

表2 加味理中汤方对脾虚泄泻小鼠肝脏指数、肾脏指数的影响Tab.2 Effect of Jiawei Lizhong Decoction on liver index and kidney index of splenic deficiency diarrhea mice 单位：%

由表2可知，与C组相比，M组小鼠肝脏指数降低19.34%（P＜0.01）。与M组相比，A组、ZL组、ZM组、ZH组小鼠肝脏指数分别升高了0.21%（P＞0.05）、15.42%（P＞0.05）、21.20%（P＜0.05）、23.77%（P＜0.01）。与A组相比，ZL组、ZM组、ZH组小鼠肝脏指数分别升高15.17%（P＞0.05）、20.94%（P＜0.05）、23.50%（P＜0.01）。各组小鼠肾脏指数差异均不显著（P＞0.05）。各组小鼠肝脏指数由低到高排序为M组＜A组＜ZL组＜ZM组＜ZH组＜C组，肾脏指数由低到高排序为A组＜M组＜C组＜ZL组=ZM组＜ZH组。

结果表明，加味理中汤方可改善脾虚泄泻造成的肝脏及肾脏指数降低，且ZH组效果最佳。

3 讨论

腹泻的病因复杂，主要包括传染性因素如病毒、细菌、寄生虫，非传染性因素如营养因素、饲养管理因素等[17]。畜禽临床中，饲养不当、营养过剩导致动物脾胃亏虚，脾虚则运化无力而湿邪内生，又因多食寒凉食物，脾阳受损又湿邪困脾，脾胃升降失常，清浊不分水谷顺肠而下，造成脾胃虚寒泄泻。《脾胃论》中言明，“大忌苦寒之药，损其脾胃”。番泻叶性味甘苦寒，归属大肠经，是建立脾虚动物模型的常用药物[18-19]，主要泻下成分为蒽醌类化合物及其衍生物[20]。研究表明，番泻叶还具抑菌、止血、降血糖、增强平滑肌收缩、肌肉松弛与解痉等作用，大剂量或长期使用会导致低钾血症、肠部炎症、肠黏膜损伤，甚至致死等[21-22]。

有研究表明，理中汤可治疗抗生素相关性腹泻，且只对寒湿泄泻有效，对实热泄泻则无效[23-24]。本试验在理中汤基础上添加了茯苓、山药、木香、桂枝、砂仁，其中茯苓、山药增强了补脾祛湿功效，木香可健脾和胃、行气止痛，桂枝、砂仁温通可增强助阳止泻效果。干姜、党参、白术、茯苓、山药、木香、砂仁均具有调节免疫、调节胃肠功能、调节肠道菌群、抗炎等作用，木香、桂枝、砂仁还具有止痛、抗菌等药理作用[25-32]，为加味理中汤方治疗脾虚泄泻提供良好的理论基础。

本研究中采用小鼠连续灌胃番泻叶的方法造成脾虚泄泻，脾虚而气血虚，导致M组小鼠红细胞数目和血红蛋白略有下降，血糖含量显著下降；脾虚而卫气不固，外邪易侵入，机体免疫力下降，M组小鼠血小板数目、淋巴细胞百分比均下降，白细胞数目、中性粒细胞百分比均升高；脾虚影响肝肾，因而肝脏指数显著降低、肾脏指数略有降低。治疗后，与M组相比，ZH组小鼠红细胞数目、血红蛋白均升高，血小板数目、肝脏指数、淋巴细胞百分比均显著升高，中性粒细胞百分比显著下降。与A组相比，ZH组小鼠血糖含量、肝脏指数均显著升高，血小板数目、肾脏指数均有所升高。

有研究表明，番泻叶造成的脾虚泄泻可导致血小板数目显著下降，红细胞数目、血红蛋白有下降趋势，其余项目无显著差异[15]。李锦灵等[33]研究表明，番泻叶可显著降低小鼠白细胞数目、淋巴细胞数目、脾脏指数、胸腺指数。番泻叶提取物会造成大鼠肝脏指数下降、肾脏指数升高[34]，大量给予抗生素后会造成小鼠血小板数目下降[35]。上述研究均与中医泄泻病位在脾胃肠，与肝肾相关的理论一致。本研究中，M组小鼠的肝脏指数、红细胞数目、血红蛋白以及血小板数目下降等变化趋势与文献一致，但白细胞数目、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比的变化趋势与上述文献存在差别，可能与造成腹泻的微生物不同有关。根据本试验结果分析，腹泻小鼠可能伴有细菌感染和炎症反应，而恩诺沙星并未造成血小板进一步降低，可能与本试验中恩诺沙星剂量为正常治疗量有关。治疗后，恩诺沙星组小鼠血常规指标和血糖含量也得到一定改善，可能与恩诺沙星的抗菌作用有关；各剂量组的中药组方均很好地回调了小鼠的血常规指标、血糖含量及肝肾脏器指数等指标，可能是由于干姜、党参、白术、茯苓、山药、木香、砂仁提高了泄泻小鼠的免疫力，以及干姜、木香、桂枝、砂仁抗菌的药理作用有关。