P2X3受体介导电针调节肠易激综合征内脏痛大鼠结肠5-HT、SERT的作用研究

周云 张方 闫翠娜 李琪 乔宇 黄榕 翁志军 杨玲 刘慧荣

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是常见的消化系统疾病,属全球流行性疾病,且患病率有逐年上升趋势。目前研究认为IBS主要与内脏高敏感、脑肠轴异常、肠道菌群失衡、生活与饮食习惯、基因易感性、社会心理因素等密切相关[1-2],其中内脏高敏感是研究热点[3]。内脏高敏感是指引起内脏疼痛或不适刺激的阈值降低,内脏组织对各种机械、化学等伤害性刺激反应强烈,包括内脏痛觉过敏、痛觉异常,扩张刺敏感性增强、反应性增加的现象,广泛存在于IBS患者中[4-5]。

本课题组前期研究证实了针灸对IBS内脏痛存在较好的镇痛效果,涉及外周、中枢等多个层面[6-8],且针灸能通过调控外周嘌呤能配体门控离子通路3(purinergicligand-gatedionchannel 3,P2X3)受体的表达来降低IBS内脏高敏感[6-7];此外,也发现针灸能通过调节结肠黏膜的5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平发挥减轻IBS内脏高敏感的现象[9]。而有研究发现5-HT的释放与P2X3受体相关[10-12],5-HT再摄取转运蛋白(serotonnin transporter,SERT)对控制胃肠道5-HT含量及其受体激活和脱敏又有重要作用,那么P2X3受体和SERT在针灸治疗IBS的作用机制中是否存在关系,成为一个新的需要解释的问题。因此,本研究将从电针调节IBS内脏痛大鼠外周机制上展开,探讨P2X3受体介导电针对IBS内脏痛大鼠结肠5-HT、SERT的调节作用,为进一步阐释针灸对IBS的作用机制提供更充分的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠,体质量140～160 g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,动物许可证号:SCXK(沪)2017-0005,饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心。饲养环境:12小时昼夜节律交替,室温(20±2)℃,相对湿度50%～70%。适应性饲养一周后开始正式实验。

1.2 伦理审查

本研究所有动物实验均通过上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心伦理审查(伦理号:PZSHUTCM190315009),整个实验过程严格按照我国实验动物管理规范执行。

1.3 主要试剂与仪器

戊巴比妥钠(P3761,美国Sigma);P2X3受体激动剂(M6517,美国Sigma);液体石蜡、氯化钠、氯化钾、无水乙醇、二甲苯、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、多聚甲醛、中性树胶粘合剂(国药集团化学试剂有限公司);苏木精、伊红(南京建成生物工程研究所);5-HT ELISA检测试剂盒(ml003125-C,上海酶联生物科技有限公司);serotonin抗体(ab172884,英国abcam);GAPDH(2118S,美国CST);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(A0208,碧云天);SYBR Green PCR试剂盒(K0223,美国Thermo);逆转录试剂盒(K1622,美国Fermentas);一次性无菌针灸针(0.25 mm×13 mm,苏州医疗用品厂有限公司);韩式经穴刺激仪(南京济生医疗科技有限公司);光学显微镜(日本OLYMPUS公司);电泳仪、转印仪(美国Bio-RAD);ABI ViiA 7 Real Time PCR System(美国Applied Biosystems)。

1.4 IBS动物模型制备

按照完全随机设计原则,50只大鼠随机分为正常组(10只)和造模组(40只)。正常组大鼠采用0.5 mL生理盐水灌肠,造模组大鼠采用三硝基苯磺酸(trinitrobrnzen sulfonic acid, TNBS)灌肠法制备IBS内脏痛模型,模型制备方法参照Annemie等[13]的操作。实验大鼠灌肠前禁食不禁水24小时。灌肠前用2%戊巴比妥钠按0.25 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠,每只大鼠注入0.5 mL生理盐水或TNBS灌肠液[TNBS(1 mol/L)∶无水乙醇∶生理盐水=51∶150∶299]。灌肠后维持大鼠倒立体位3～5分钟防止渗出,待大鼠清醒后给予正常饮食饮水,常规饲养3周后在正常组和造模组大鼠中随机各选择2只进行模型鉴定。实验过程中造模组有3只大鼠死亡,1只造模不成功,最后每组纳入8只。

1.5 动物分组与干预

在确定IBS内脏痛模型制备成功后,将造模组大鼠随机分为模型组(MG)、电针组(EA)、P2X3受体激动剂组(α,β-meATP)、P2X3受体激动剂+电针组(α,β-meATP+EA)。所有大鼠于造模3周后开始干预,正常组和模型组采用与电针组相同的抓取、大鼠固定架固定,不做其他处理,连续7天;电针组:选取双侧上巨虚、天枢穴[9],直刺,针刺深度均为5 mm,针柄连接韩氏经穴刺激仪,疏密波、频率2/100 Hz、电流1 mA,30分钟/次,每日1次,连续7天;P2X3受体激动剂组:先麻醉大鼠,然后用微量注射器从大鼠第4、5腰椎棘突间垂直刺入髓鞘内,大鼠尾部出现甩尾反应后,注射P2X3受体激动剂α,β-meATP 10 μL[14],浓度10 nmol/μL,连续7天;P2X3受体激动剂+电针组:先在大鼠髓鞘内注射P2X3受体激动剂α,β-meATP 10 μL,约30分钟后再进行电针干预,电针干预操作同电针组,连续7天。

1.6 标本采集

标本采集前用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,麻醉后将大鼠放置大鼠解剖台上,剪开腹部皮肤,暴露腹腔,在大鼠肛门上3 cm处向上取出约4 cm长的结肠组织,沿肠系膜处纵行剪开肠管,用生理盐水冲洗结肠,然后分成4份,1份置于4%多聚甲醛溶液内固定24小时后脱水包埋切片,用于苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色;另3份置于-80℃冰箱保存,用于酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白质印迹法(Western blot)、实时荧光定量PCR检测。

1.7 指标检测

1.7.1 腹部撤回反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)评分 于干预前和干预结束后对大鼠进行AWR评分,评分标准参照AL-chaer等[15]的操作。评分前实验大鼠禁食不禁水24小时,操作前用自制球囊蘸取少量液体石蜡,顺大鼠直结肠生理曲度缓慢从肛门插入,深度为4～6 cm,将大鼠尾部同球囊一起固定,然后将大鼠放置在评分盒中,让大鼠在盒中自由活动约30分钟。待大鼠适应环境后,用三通阀连接球囊和血压计,分别进行20、40、60、80 mmHg四个不同压力的结肠扩张(colorectal distention,CRD)刺激。每只大鼠每个压力测量3次AWR评分,每次持续约20秒,同一压力之间间隔1分钟,不同压力之间间隔4分钟,取均值作为最后评分值。

1.7.2 HE染色 将4 μm的结肠石蜡切片放进60℃烘干箱中烘片60分钟;二甲苯Ⅰ15分钟;二甲苯Ⅱ15分钟;梯度酒精100%→90%→80%→70%,各3分钟;流水冲洗10分钟;苏木精染色2分钟;流水冲10分钟;1%盐酸酒精分化1秒;流水冲洗10分钟;伊红染色2分钟;梯度酒精70%→80%→90%→100%,各1分钟;二甲苯Ⅰ15分钟;二甲苯Ⅱ15分钟;中性树胶封片;光学显微镜下观察,采集图片。

1.7.3 ELISA检测 将0.5 mg/mL标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20 μL依次加入96孔酶标板标准孔中,用生理盐水补足到50 μL;除空白孔外,酶标板样本孔中依次加入待测样本各10 μL,再加入样本稀释液各40 μL;然后依次加入一抗5-HT,空白孔不加;将酶标板置于37℃恒温箱中孵育60分钟后,将酶标板用滤纸吸干;每孔中加入稀释好的洗涤液,洗涤1分钟,用滤纸吸干,重复5次;每个孔中依次加入试剂盒底物A、B,将酶标板置于37℃恒温箱中避光孵育20分钟;最后加入终止液50 μL,置于酶标仪中测定450 nm波长的吸光值,根据标准曲线计算出样本浓度。

1.7.4 Western blot检测 用RIPA和PMSF裂解结肠组织,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,制备10% SDS-PAGE蛋白电泳凝胶,加入蛋白样品,设置85V恒压电泳至分离胶底部;电泳结束后,将PVDF膜及凝胶固定于转印夹中,125V转膜60分钟,转膜结束后,剪下目的条带,用5%BSA室温封闭60分钟;将PVDF膜浸泡于SERT(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)抗体中,4℃摇床孵育过夜;PBST洗膜4次,每次10分钟;将PVDF膜浸泡于辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(1∶1 000)抗体中,室温摇床孵育1小时;采用凝胶成像系统进行图像采集,Image J软件进行数据采集。

1.7.5 实时荧光定量PCR检测 用Trizol试剂裂解结肠组织,然后利用氯仿、异丙醇和乙醇提取结肠组织总RNA,检测浓度、纯度、完整性。以提取的细胞总RNA为模板,按逆转录试剂盒说明操作进行反转录反应,获得cDNA后进行PCR扩增反应,扩增条件为:95℃ 30秒,95℃ 5秒,60℃ 5秒,共40个循环。GAPDH为内参,以2-△△Ct值计算蛋白的相对表达量。PCR引物序列由ABI公司的Primer Express Software v 2.0设计,由华大基因公司合成。SERT上游引物:GTGCTCATCTTCACCGTAATC;SERT下游引物:TTTCTGCCAGTTGGGTTTC;GAPDH上游引物:GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC;GAPDH下游引物:ATGAGCCCTTCCACGATGC。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 结肠组织病理学观察

造模3周后对正常组和造模组大鼠进行结肠HE染色。结果显示:正常组大鼠结肠各层组织结构完整,腺体形态正常分布均匀,黏膜层和黏膜下层无明显充血、水肿、溃疡或炎性细胞浸润;造模组大鼠结肠各层组织结构完整,腺体形态正常分布均匀,黏膜层和黏膜下层有少量炎症细胞浸润和轻微充血水肿。两组间无明显形态学差异,符合IBS临床无明显形态学改变的结肠病理表现。见图1。

注:A:正常组;B:模型组。

干预结束后取各组大鼠结肠组织进行HE染色。结果显示:正常组大鼠结肠组织结构完整,腺体排列整齐,黏膜层无明显充血水肿或炎性细胞浸润;模型组大鼠结肠组织结构完整,黏膜层和黏膜下层有少量嗜酸性粒细胞浸润,黏膜下层见充血水肿;电针组大鼠结肠组织结构完整,腺体排列整齐,黏膜层和黏膜下层有少量嗜酸性粒细胞浸润和轻度充血水肿;P2X3受体激动剂组大鼠结肠黏膜组织结构完整,黏膜层和黏膜下层有炎性细胞浸润,黏膜下层见明显充血水肿;P2X3受体激动剂+电针组大鼠结肠组织结构完整,黏膜层和黏膜下层有少量炎性细胞浸润,黏膜下层见轻度充血水肿。各组间无明显形态学差异,见图2。

注:A:正常组;B:模型组;C:电针组;D:P2X3受体激动剂组;E:P2X3受体激动剂+电针组。

2.2 行为学观察

造模3周后对各组大鼠进行干预前AWR评分。结果显示,造模组与正常组比较,在各个压力强度CRD刺激下的AWR评分均明显升高(P<0.05,P<0.01),结合干预前结肠组织HE染色结果说明IBS内脏痛大鼠模型制备成功。见表1。

表1 正常组与造模组大鼠造模后AWR评分比较[M(QU-QL)]

干预结束后对各组大鼠进行干预后AWR评分。结果显示,与正常组比较,模型组大鼠在40、60 mmHg压力CRD刺激下的AWR评分均明显升高(P<0.05),在20、80 mmHg压力CRD刺激下的AWR评分差异无统计学意义,但是也呈上升趋势,从行为学角度说明IBS慢性内脏痛敏形成;与模型组比较,电针组大鼠在40、80 mmHg压力CRD刺激下的AWR评分均降低(P<0.05,P<0.01),在20、60 mmHg压力CRD刺激下的AWR评分差异无统计学意义,但是也呈下降趋势,说明电针能够缓解IBS大鼠内脏痛。与模型组、P2X3受体激动剂组比较,P2X3受体激动剂+电针组大鼠在各个压力强度CRD刺激下的AWR评分均降低;而与电针组比较,P2X3受体激动剂+电针组大鼠在各个压力强度CRD刺激下的AWR评分均升高,说明电针可能部分抑制了P2X3受体激动剂的作用,从而降低痛阈。见表2。

表2 各组IBS大鼠经不同干预后AWR评分比较[M(QU-QL),鼠只=8]

2.3 大鼠结肠5-HT含量检测

采用ELISA法检测大鼠结肠中5-HT的含量。结果显示,与正常组比较,模型组大鼠结肠中5-HT含量升高(P<0.01);与模型组比较,电针组、P2X3受体激动剂+电针组大鼠结肠中5-HT含量均降低(P<0.05);与电针组比较,P2X3受体激动剂组大鼠结肠中5-HT含量升高(P<0.01),P2X3受体激动剂+电针组大鼠结肠中5-HT含量升高。结果说明电针能够下调IBS大鼠结肠中5-HT的含量,且这种调节作用可能与电针抑制了P2X3受体相关。见表3。

表3 各组IBS大鼠结肠5-HT表达比较鼠只=8)

2.4 大鼠结肠SERT表达检测

采用Western Blot法检测大鼠结肠中SERT蛋白表达。结果显示,与正常组比较,造模组大鼠结肠中SERT蛋白均降低(P<0.01);与模型组比较,电针组大鼠结肠中SERT蛋白表达升高(P<0.01),P2X3受体激动剂+电针组大鼠结肠中SERT蛋白表达升高;与电针组比较,P2X3受体激动剂组大鼠结肠中SERT蛋白表达降低(P<0.01),P2X3受体激动剂+电针组大鼠结肠中SERT蛋白表达降低(P<0.05)。结果说明电针干预能够上调IBS大鼠结肠中SERT蛋白表达,且这种调节作用可能与电针抑制了P2X3受体相关。见图3,表4。

表4 各组IBS大鼠结肠SERT受体蛋白与mRNA表达量比较鼠只=8)

图3 各组IBS大鼠结肠SERT蛋白表达情况

采用实时荧光定量PCR检测大鼠结肠中SERT mRNA的表达。结果显示:与正常组比较,造模组大鼠结肠中SERT mRNA表达均降低(P<0.01);与模型组比较,电针组大鼠结肠中SERT mRNA表达升高(P<0.01),P2X3受体激动剂+电针组大鼠结肠中SERT mRNA表达升高(P<0.05);与电针组比较,P2X3受体激动剂组大鼠结肠中SERT mRNA表达降低(P<0.01),P2X3受体激动剂+电针组大鼠结肠中SERT mRNA表达降低。结果与SERT蛋白检测结果一致,说明电针干预能够上调IBS大鼠结肠中SERT的表达,且这种调节作用可能与电针抑制了P2X3受体相关。见表4。

3 讨论

中医经典理论中并没有肠易激综合征这个病名,根据IBS的主要临床表现,可将其归纳为“腹痛”“泄泻”“便秘”等病证范畴。针灸疗法作为中医学中的特色疗法,具有调理脏腑、疏通经络、调和气血、扶正祛邪等功效,针灸疗法以中医整体观和辨证论治为指导,四诊合参,病证结合,在治疗IBS方面经验丰富,疗效确切[16]。天枢穴、上巨虚穴皆属于足阳明胃经,二者合用属于合募配穴,是治疗腹痛、腹泻或便秘的经典有效配穴,同时两者一升一降,一上一下,相互协同可达通畅肠腑气机、祛除病邪之功效[17]。

本实验研究采用TNBS灌肠制备IBS内脏痛大鼠模型的方法是比较常用的造模方法[18]。该方法制备的IBS大鼠模型以慢性内脏痛表现为主,而结肠组织没有明显的病理改变,符合IBS的病理学特征[19]。临床与动物研究[20-21]均证明针灸疗法作为一种替代疗法在IBS的治疗中有较好的疗效,尤其是电针疗法在镇痛方面得到了国际的认可[22]。本实验研究采用合募配穴电针干预IBS内脏痛大鼠,发现电针干预后的IBS内脏痛大鼠AWR评分明显降低,说明电针能够降低IBS大鼠的内脏高敏感,缓解IBS内脏痛。

5-HT是一种与胃肠关系密切的脑肠肽,与IBS内脏痛的发生发展密切相关[23]。5-HT信号通路的改变在IBS的启动和维持环节发挥着重要作用,可能导致肠道功能异常和敏感性增加[24-25]。SERT是一种负责从肠道或组织间隙中再摄取5-HT的转运蛋白,是5-HT信号通路的必须成员,对控制肠道内5-HT含量及其受体的激活和脱敏具有重要作用[26-27]。SERT表达减少会导致肠上皮细胞内5-HT的降解受损,肠道内5-HT的浓度增加,致使5-HT受体脱敏,肠道感觉出现异常[28]。本实验研究也发现IBS内脏痛大鼠结肠黏膜中SERT蛋白和mRNA表达明显减少,而IBS内脏痛大鼠结肠组织中5-HT含量显著升高,说明SERT表达减少会导致肠道或组织间隙内的5-HT释放增多,加重IBS大鼠内脏痛敏反应,与文献报导的研究结果一致[29-30]。而电针干预能上调IBS内脏痛大鼠结肠黏膜中SERT蛋白和mRNA表达,降低IBS内脏痛大鼠结肠组织中5-HT含量,说明SERT、5-HT参与了电针缓解IBS内脏痛的作用机制。

研究发现P2X3受体和5-HT受体在功能上存在相互作用,在P2X3受体亚基缺乏小鼠体内发现初级传入神经元中的5-HT信号传导发生了变化,在P2X3基因敲除小鼠中发现5-HT释放明显增多[10],但具体的机制尚不清楚。本团队在前期研究中发现电针能通过降低结肠组织的P2X3受体缓解IBS内脏痛[6-7],而肠嗜铬细胞中的P2X3受体也能调节5-HT信号的变化[31],那么电针降低结肠组织的5-HT含量和升高结肠组织的SERT表达是否有P2X3受体的参与呢?为了验证这一猜测,本团队在IBS内脏痛大鼠鞘内注射P2X3受体激动剂α,β-meATP,激活大鼠结肠初级感觉神经元上的P2X3受体,观察IBS内脏痛大鼠的行为学变化和结肠SERT与5-HT的表达变化。结果发现P2X3受体激动剂+电针组大鼠的AWR评分较P2X3受体激动剂组降低,而较电针组升高;P2X3受体激动剂+电针组大鼠结肠5-HT含量较P2X3受体激动剂组降低,而较电针组升高;P2X3受体激动剂+电针组大鼠结肠SERT蛋白和mRNA表达较P2X3受体激动剂组升高,而较电针组降低,说明P2X3受体参与了电针对IBS内脏痛大鼠结肠5-HT和SERT的调节作用,而电针可能是通过抑制结肠P2X3受体减少了肠道内5-HT的释放激活了SERT的表达,有效地改善了IBS大鼠的内脏痛症状。

以上研究结果为结肠P2X3受体参与电针缓解IBS大鼠内脏痛的作用机制提供了更多的分子生物学实验证据,但仍存在一些未能解决的问题需要进一步研究,比如外周和中枢其他部位的P2X3受体是否也参与对IBS内脏痛大鼠5-HT和SERT的调节作用,以及SERT与P2X3受体在IBS内脏痛的发生发展及电针缓解IBS内脏痛的过程中是否存在反馈调节作用,还有待于在今后的实验中进一步探索。