以线粒体自噬为靶点的益气活血类中药保护心肌缺血再灌注损伤研究进展

蔡丹阳 李洁 李运伦

来自全球疾病负担的数据显示,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是致残率、致死率较高的疾病之一[1]。冠状动脉疾病会导致冠状动脉血流受限或缺血症状,是CVD最常见的形式。由于及时的再灌注医疗策略,如经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)和冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting,CABG),可同时促进心肌梗死边缘区血流量的恢复和挽救濒死的心肌细胞,在过去几十年中CVD死亡率有所降低。但在此过程中往往会引起心肌的二次损伤,即心肌缺血再灌注损伤。心肌缺血再灌注损伤有多种机制,包括线粒体自噬、线粒体Ca2+超载、活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成、血小板活化、微血栓形成等,其中线粒体自噬是新近研究热点。研究证实益气活血类中药能增强或减弱线粒体自噬从而防治缺血性心脏病。本文就近年来采用益气活血法调控线粒体自噬防治缺血性心脏病的相关研究进行归纳总结,以期为益气活血法防治心肌缺血再灌注损伤的临床应用提供新的依据。

1 线粒体自噬途径及其在心肌缺血再灌注损伤中的作用

Lemasters[2]于2005年首次提出“线粒体自噬”概念。研究表明,线粒体功能障碍是导致缺血性心脏病发生的主要原因。线粒体自噬可以清除功能异常的线粒体和用新的线粒体代替之间取得良好的平衡,最大程度保护心肌细胞。线粒体自噬缺陷可导致动物心脏退行性疾病并改变线粒体自噬通量,这也被证明会影响一些心血管疾病的预后,如心肌梗死、各种类型的心肌病和动脉粥样硬化等。在哺乳动物细胞中,有多条信号通路被证实参与介导线粒体自噬的过程,目前介导线粒体自噬的调节机制主要包括诱导同源性磷酸酶张力蛋白诱导的激酶1(PINK1-Parkin)、BCL2 相互作用蛋白3(BCL2 interacting protein 3,BNIP3)/NIP3样蛋白X(NIP3-like protein X,NIX)(BNIP3/NIX),以及FUNDC1 (FUN 14 domain containing protain 1)等[3-5],见图1。

图1 线粒体自噬途径及其在心肌缺血再灌注损伤中的作用

1.1 PINK1-Parkin途径

PINK1-Parkin途径是线粒体自噬最经典的方式之一。在健康的线粒体中,PINK1位于线粒体外膜,可利用氨基末端的线粒体靶向序列,在转位酶的带动下到达内膜进行降解。整个过程中,PINK1可以持续不断地监测线粒体不同时期的健康状态,并在线粒体功能受到阻碍时,快速发出信号[6]。当线粒体受损,线粒体通透性转换孔(mitochondral permeablity transition pore,mPTP)的去极化,导致PINK1在线粒体外膜处积聚,将部分泛素磷酸化,并促进Parkin向线粒体外膜募集和激活。激活后的Parkin可以泛素化电压依赖性阴离子通道(voltagedependent anion-selective channel 1,VDAC1)、线粒体融合蛋白(mito-fasion 1,MFN1)/MFN2等,泛素化的MFN2通过蛋白酶体降解,导致线粒体分裂,同时泛素化的VDAC1会募集自噬受体OPTN,进而诱导线粒体自噬[7-8]。而当PINK1-Parkin和其他线粒体自噬相关基因发生突变时,就会导致线粒体自噬功能障碍,进一步导致受损线粒体的积累、氧化应激以及神经元死亡[9-10]。

当心肌缺血再灌注发生时,线粒体膜电位上升导致线粒体Parkin蛋白加速转运,线粒体自噬被激活。Siddall等[11]采用缺血再灌注模型,发现敲除Pink1基因的小鼠,心肌细胞线粒体形态杂乱无章,梗死面积显著增加,同时ROS诱导的线粒体膜电位去极化也更敏感。另一项关于Parkin1基因敲除研究中发现,实验组相较于对照组线粒体紊乱更为显著,在缺血再灌注中心肌损伤面积更大、小鼠生存率更低[12]。因此,PINK1-Parkin介导的线粒体自噬,通过清除受损线粒体在心肌中的累积,减少心脏梗死面积,治疗缺血性心脏病。

1.2 BNIP3/NIX途径

BNIP3和NIX是一种同源蛋白,均定位于线粒体,具有相同LIR基序,可与LIR结合作为自噬受体,直接与自噬体上的LC3结合,其中BNIP3与LC3的结合需要其同二聚体化,进而诱导线粒体自噬的发生。但是,在线粒体自噬过程中BNIP3和NIX的表现略有不同,BNIP3在缺氧期间调节线粒体自噬,BNIP3的功能涉及相反的两方面:一方面是诱导细胞凋亡或坏死,起到促进死亡的作用;另一方面,引起自噬或线粒体自噬,起到促存活作用,而NIX调节红细胞谱系成熟时线粒体的自噬过程[13-17]。当细胞处于恶劣的环境下,BNIP3可诱导过度线粒体自噬,导致细胞死亡,而NIX并不能诱导过度的线粒体自噬[18-19]。

BNIP3/NIX介导的线粒体自噬主要作用于缺血性心脏病早期。缺血再灌注时,心肌细胞处于严重缺血、缺氧的状态,活性氧类物质(reactive oxygen species,ROS)的大量生成,ROS生成后,快速激活BNIP3介导的线粒体自噬并清除功能异常的线粒体,同时利用此过程分解得到的氨基酸和脂肪酸,来帮助细胞渡过缺血缺氧导致的能量耗竭,恢复细胞稳态[20-21]。有学者发现,在SD大鼠缺血再灌注早期,BNIP3表达量会随着缺血再灌注时间点的升高而升高,缺血缺氧的状态也随之不断变少[22]。因此,通过BNIP3介导的线粒体自噬可有效清除损伤的线粒体,对ROS的大量释放及细胞死亡通路的激活有重要作用。

1.3 FUNDC1途径

FUNDC1是由中国科学院动物研究所陈佺研究员课题组发现的,通过启用线粒体自身的蛋白酶系统或线粒体自噬机制帮助细胞维持蛋白质稳态[23-24]。健康状态下,FUNDC1被第13位丝氨酸的激酶(casein kinase 2,CK2)和第18位酪氨酸的激酶(src family kinase,Src)磷酸化,处于磷酸化状态下的FUNDC1与LC3相互作用不明显。而在心肌缺血缺氧状态下,PGAM5脱磷磷酸化FUNDC1,去磷酸化的 FUNDC1和LC3相互作用增强,从而第一时间激发线粒体自噬[25-27]。

迄今为止,大多数研究证实FUNDC1介导的线粒体自噬在心肌缺血再灌注损伤中具有保护作用。研究发现 Mst1在缺血再灌注后显著上调,并且Mst1通过抑制RK-CREB信号通路和抑制FUNDC1介导的线粒体自噬,防止心肌缺血再灌注发生[28]。另有研究发现,缺血再灌注后,Ripk3明显上调,从而抑制FUNDC1介导的线粒体自噬,因此,FUNDC1通路的调控,可能是心脏再灌注损伤中心脏保护的一种新策略[29]。以上结果提示,适当促进再灌注时期,心脏微血管内皮细胞中FUNDC1介导的线粒体自噬,有利于心肌保护。

2 益气活血类中药干预线粒体自噬治疗心肌缺血再灌注

研究表明,中药单体、组分、复方都可以通过调节不同通路或受体蛋白介导线粒体自噬,保护缺血再灌注损伤。通过研究益气活血类中药的有效成分、药理作用及分子机制,最大限度发挥靶向调节作用,是研究缺血性心脏病的重要研究方向之一。

2.1 干预PINK1-Parkin信号通路介导的线粒体自噬

黄芪甲苷是黄芪皂苷中主要活性成分之一。在缺血性心脏病中可防止心肌纤维化,提高心肌收缩能力,保护心肌细胞免受缺血、缺氧的损伤[30-31]。李旭阳等[32]通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型,结果表明,黄芪甲苷通过作用于PINK1-Parkin途径,可明显降低心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST),抑制心肌细胞凋亡,改善线粒体自噬,治疗缺血性心脏病。张东伟等[33]实验同样在大鼠缺血再灌注模型中检测生化指标CK-MB、总胆固醇(cholesterol,CHOL),结果表明黄芪甲苷对缺血再灌注损伤的心肌的保护作用可能与降低炎症反应、抑制PINK1-Parkin 通路介导的线粒体过度自噬相关。除此之外,黄芪甲苷还可基于PINK1-Parkin通路,减少自噬体聚集,改善线粒体功能,抑制自噬蛋白如LC3II及P62的表达,保护心肌细胞,防止缺血再灌注损伤。

三七总皂苷是中药三七中极重要的活性成分之一。在心肌缺血缺氧状态下,三七总皂苷可显著增强ATP酶活性成分,加速线粒体生成与转化,减少因线粒体受损引起的的缺血、缺氧、细胞损伤,调节线粒自噬。杨子平等[34-35]实验表明,三七总皂苷能降低再灌注损伤中血清心肌损伤标志物LDH和CK的含量,防止活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量产生与累积,通过抑制线粒体自噬PINK1-Parkin通路,影响线粒体自噬结合和裂解,进而保护心脏。三七总皂苷防止缺血再灌注损伤文献中少有涉及,目前研究表明,三七总皂苷主要通过自噬通路PINK1-Parkin,抑制心肌纤维化,缓解氧化应激,治疗缺血性心脏病。

加味丹参饮在缺血性心脏病中,具有减少炎症因子,降低心肌线粒体肿胀,改善线粒体功能,调节自噬等作用[36-37]。杨艳红等[38]发现,加味丹参饮可明显升高模型组Parkin蛋白的表达,使冠状动脉内皮细胞超微结构有所改变。因此,加味丹参饮在线粒体自噬过程中,严格把控线粒体质量和数量,并通过PINK1-Parkin通路激活线粒体自噬,减轻缺血再灌注损伤。在治疗缺血性心脏病中,不仅遵守了益气活血的治疗准则,其有效成分在后期的调养中也发挥着必不可少的作用。

益脉颗粒具有补气、活血、滋阴等功效。由于其重要的抗心律失常、抗血栓,减轻心肌炎症、抑制细胞凋亡、改善心肌缺血缺氧等功能,被广泛应用于缺血性心脏病的治疗当中[39-40]。张东伟[41]的研究发现,益脉颗粒给药后,线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、P62表达量明显降低,并通过PINK1-Parkin的调节,促进线粒体融合、分裂,维持线粒体动态平衡,进而减轻大鼠缺血再灌注心肌损伤。综上,经益脉颗粒干预后,大鼠心肌纤维排列整齐,其有效成分可改善心肌组织间的水肿,减少炎性细胞。因此,益脉颗粒可通过PINK1-Parkin通路保护心肌,治疗缺血性心脏病。

益气活血方是在补阳还五汤的基础上研制而成,由益气药和活血药组成。罗晨曦[42]研究发现,LC3I、LC3II、PINK1、Parkin、P62分别作为自噬标志物,在缺血再灌注损伤中,益气活血方可明显增加PINK1、Parkin、P62蛋白与抑制LC3II/LC3I自噬蛋白的表达,因此推测益气活血方通过PINK1-Parkin途径,抑制线粒体过度自噬,维持线粒体质量与数量,保护线粒体结构功能,改善线粒体肿胀与结构的破裂,进而治疗缺血性心脏病。

通心络胶囊在缺血性心脏病中发挥着不可替代的作用,它可以通过上调AMPK蛋白表达,抑制缺血缺氧诱导的心肌细胞凋亡[43]。YANG等[44]采用大鼠缺血再灌注损伤模型,经检测自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、p62、Beclin1表达水平发现,通心络可以通过PINK1-Parkin线粒体自噬通路,与泛素蛋白酶一同清除损伤的线粒体,维持胞内平衡,进而治疗缺血性心脏病。除此之外,通心络胶囊可以增加血管弹性,降低炎症因子的释放,有利于治疗缺血性心脏病。

2.2 干预BNIP3/NIX信号通路介导的线粒体自噬

三七总皂苷作为常用的治疗心血管疾病的天然产物成分[45],研究发现,通过结扎冠状动脉左前降支,构建SD大鼠缺血再灌注模型, 给药三七总皂苷预处理7天,心肌组织中大量的HIF-1α、BNIP3 和 Beclin1被激活,血清中CK-MB、LDH等炎症标志物降低,自噬蛋白LC3II/LC3I表达升高,心肌组织线粒体损伤减弱。因此,三七总皂苷可以通过激活BNIP3/NIX途径,降低炎症因子表达,增强线粒体自噬, 有效防止缺血再灌注损伤。

丹酚酸B是一种酚类化合物,对缺血性心肌具有保护作用[46]。实验结果表明,通过缺氧4小时复氧2小时,构建H9c2心肌细胞模型,通过给药丹酚酸B,可降低LC3-II/LC3-I比值及促凋亡蛋白(NIP3-like protein X,NIX)表达水平,并升高线粒体膜电位[47]。辛高杰等[48]的一项研究同样表明,丹酚酸B能够保护H9c2心肌细胞中缺血再灌注损伤, 增加线粒体膜电位,削弱caspase-3和LC3II的蛋白表达,同时增加细胞活性。因此,丹酚酸B通过促凋亡,减少心肌缺血、缺氧,对心肌细胞的保护作用机制均与NIX介导的线粒体自噬密切相关。

2.3 干预FUNDC1介导的线粒体自噬

双参宁心胶囊主要包括人参总皂苷、延胡索生物碱和丹参总酚酸。双参宁心胶囊可以益气、化瘀、改善心脏凝血功能,减轻缺血缺氧状态下的心肌损伤,维持稳定的线粒体功能,保护心脏[49]。辛高杰等[50-51]采用大鼠缺血再灌注损伤模型,通过检测血清中损伤标志物CK、LDH、CK-MB明显升高,Western blot 实验中FUNDC1蛋白表达增高,表明缺血再灌注损伤时FUNDC1介导的线粒体自噬被激活。因此,双参宁心胶囊可通过FUNDC1通路抑制线粒体自噬,防止缺血性心脏病的发生。具体详见表1。

表1 益气活血类中药单体及复方调控线粒体自噬治疗缺血性心脏病

本实验室也针对FUNDC1信号通路做了相关研究,通过构建心肌缺血再灌注损伤小鼠模型,从调节内皮细胞线粒体自噬的角度,研究人参皂苷RG1与三七皂苷R1组分对模型小鼠的抗心肌再灌注损伤作用机制。结果发现,RG1-R1组分药改善了心肌缺血再灌注损伤小鼠的心功能,逆转了心肌缺血再灌注损伤小鼠心脏的心肌病理变化;其次,电镜结果发现RG1-R1组分药能促进 FUNDC1介导的线粒体自噬,干预心肌缺血再灌注损伤,且其调控 FUNDC1 介导的线粒体自噬的机体机制可能与CK2α通路密切相关。

3 小结

线粒体是心肌细胞能量的主要源泉,参与调控细胞凋亡与信号转导等关键环节。当细胞处于缺血、缺氧环境中,受损线粒体会发生选择性、有序性自噬降解,以维持心肌细胞内环境稳态和某些细胞器的更新。线粒体自噬作为机体的一种选择性降解机制,在心肌细胞中发挥了双刃剑作用。过度激活线粒体自噬会导致线粒体大量丢失,线粒体自噬不足会导致线粒体堆积,引发心肌的功能障碍。只有适当调控线粒体自噬机制,及时清除受损线粒体,维持线粒体质量与体内能量供应,防止损伤后的炎症反应和纤维化等,才能改善心功能,减轻心肌缺血再灌注损伤。线粒体自噬防治缺血再灌注损伤主要通过PINK1-Parkin、FUNDC1、BNIP3L/NIX等信号通路启动,不同途径间存在相互联系和影响。

中医药治疗缺血性心脏病具有全面性、灵活性、 毒副作用小、 药源丰富等特色和优势。综上,益气活血类中药单体(丹参酮IIA、三七皂苷、人参皂苷、丹酚酸B、黄芪甲苷等)及中药复方(益气活血方、双参宁心胶囊等)可通过调节线粒体自噬途径,发挥防止线粒体肿胀与结构的破裂,降低炎症因子,抑制心肌细胞凋亡等作用,进而治疗缺血性心脏病(见表1)。除此之外,益气活血类中药可能具有其他有益作用,包括调控代谢、抗炎和抗氧化等。

如何使线粒体自噬最大程度的发挥保护心肌缺血、缺氧的作用,还需进一步研究探索。目前益气活血类中药改善缺血再灌注损伤仍处于初级阶段,动物模型参差不齐,统一标准不够完善,临床实验证据不足,除经典通路和蛋白外其他机制涉及不多等诸多问题。虽然益气活血类中药单体及复方在一定程度被证明有效,但仍没有发挥出最大潜力。益气活血类中药是否比已知的自噬调节剂如HDAC抑制剂、二甲双胍、环孢素和mTOR抑制剂更具优势尚不清楚,但这篇综述有助于阐明新型自噬调节剂的设计,从而为未来治疗缺血性心脏病的线粒体自噬精细控制指明方向。