芦荟多糖对自身免疫性甲状腺炎小鼠辅助型T 细胞亚群的影响

沈维亚，吴朝文

自身免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis，AT）是一种常见的甲状腺疾病，多发于中年女性，主要是由淋巴细胞浸润且伴有自身抗体形成，导致患者的甲状腺肿大、功能出现异常［1-2］。目前临床患者症状较轻且治疗AT 的药物较少［3-4］，因此寻求一种治疗AT 的药物对临床有着重要意义。芦荟属于百合科植物［5-6］，含有丰富的糖类、氨基酸、各种有机酸及蒽醌类化合物。其中芦荟多糖占芦荟凝胶的60%左右，其化学结构为线性的β-（1，4）-D 甘露糖作为基本单元组成的长链聚合物。研究显示［7］，芦荟多糖具有抗肿瘤、抗辐射、抗菌消炎及抗烫伤等功效，还具有降低血糖及免疫调节等药理作用。有研究显示［8-9］，芦荟多糖对机体免疫系统功能有全面的调节作用，可促进T、B 淋巴细胞的分化和增殖，同时增加T 细胞的细胞毒性，并提高巨噬细胞内乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶、精氨酸酶活性，进而促进机体肿瘤坏死因子α 及白细胞介素1 等的释放。本研究将对AT 小鼠模型进行芦荟多糖的治疗，旨在分析芦荟多糖对AT 小鼠的甲状腺功能及辅助型T 细胞亚群的影响。

1 材料与方法

1.1 研究材料

将50 只健康无特定病原体的BALB/C 雌性小鼠（广州市谨为生物科技有限公司，NIH 小鼠，动物批号：JW019）随机分为芦荟多糖低、中、高剂量组、AT 组、对照组，每组各10 只，所有小鼠均为6～8 个月，体重在16～18 g。其中对照组小鼠均为健康小鼠，AT 组及芦荟多糖低、中、高剂量组均为AT 小鼠，芦荟多糖低、中、高剂量组采取药物治疗。本次小鼠研究均经过深圳市龙华区中心医院动物伦理委员会批准（批准编号：GDY1902240）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 使用猪甲状腺球蛋白免疫联合高碘水法建立小鼠AT 模型，主要方法如下：将猪甲状腺球蛋白（porcine thyroglobulin， pTg）与等量体积完全弗氏佐剂制成终浓度为0.25 mg/ml 的油包水乳剂，并按50 μg/只，于小鼠背部皮下多点注射，1 次/周，连续2 周。第3 周后按50 μg/只，于背部皮下多点注射不完全弗氏佐剂与pTg 等体积制成终浓度为0.25 mg/ml 的油包水乳剂，1 次/周，连续3 周，同时每天饮用高碘水（剂量：0.63 mg/ml NaI），建立小鼠AT 模型。

1.2.2 芦荟多糖提取 取新鲜芦荟叶切成10 mm厚，干燥箱烘干（50 ℃，48 h）。粉碎机粉碎干燥的芦荟片，制成芦荟细粉，将芦荟细粉置于黑色或棕色瓶中密封保存备用。芦荟多糖主要提取工艺如下：芦荟细粉按料液比为1∶20（g/ml）复水，超声处理（中国西门子有限公司SSA-770A，功率：800 W，时间：9 min），离心机离心［美国贝克曼勒特 OPTIMA XE-90，9 000 r/min（离心半径为8 cm）15 min］，过滤，取滤液。使用旋转蒸发仪浓缩处理（0.08 MPa，60 ℃），浓缩至浓稠状，再按体积比1∶4 加入无水乙醇，静置过夜（4 ℃），离心10 min［2 500 r/min（离心半径为8 cm）］，取沉淀物，即为芦荟多糖。

1.2.3 治疗方法 芦荟多糖低、中、高剂量组小鼠分 别 灌 胃 给 药150 mg·kg-1·d-1、300 mg·kg-1·d-1、600 mg·kg-1·d-1，而AT 组及对照组给予等量的生理盐水灌胃，连续治疗4 周。

1.2.4 检测方法 5 组治疗4 周后麻醉小鼠，并对小鼠采用脊椎脱臼处理法处死，收集小鼠外周血，依据体重不同采集其体重的1%～3%，在0.2～0.6 ml，并置于室温下6 h，然后采用医用离心机，以3 000 r/min（离心半径为8 cm）离心20 min，取上清液。采用化学发光法检测所有血清样本的促甲状腺激素（thyroid-stimulating hormone， TSH）、游离三碘甲状腺原氨酸（free triiodothyronine， FT3）、游离四碘甲状腺原氨酸（free tetraiodothyronine， FT4）。依据试剂盒的说明书进行检测。试剂盒购自上海艾博生物科技有限公司（B11689-Hu）。

对于辅助T 淋巴细胞亚群，需取小鼠的外周血和脾脏组织，并分离外周血单个核细胞和脾细胞悬液。室温孵育半小时后采用流式细胞仪检测CD3+CD8+IL-4+（白细胞介素-4， interleukin-4）辅助T 淋巴细胞和CD3+CD8+IFN-γ+（干扰素，interferon）频率，试剂盒购自上海艾博生物科技有限公司（CB10096-Hu）。

1.3 观察指标

（1）比较芦荟多糖低、中、高剂量组、AT 组、对照组小鼠的甲状腺功能指标水平：TSH、FT3 及FT4；（2）比较5 组小鼠外周血CD3+CD8+IL-4+辅助T 淋巴细胞和CD3+CD8+IFN-γ+辅助T 淋巴细胞水平；（3）比较5 组小鼠脾脏组织CD3+CD8+IL-4+辅助T 淋巴细胞和CD3+CD8+IFN-γ+辅助T 淋巴细胞水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS 24.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用F检验，2 组间比较采用t检验。计数资料以频数表示。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠的甲状腺功能指标比较

在芦荟多糖治疗4 周后，芦荟多糖低、中、高剂量组及AT 组小鼠的TSH 水平比对照组高，而FT3、FT4 水平较低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。芦荟多糖低、中、高剂量组较AT 组TSH 水平降低，而FT3、FT4 水平升高（P＜0.05）。见表1。

表1 芦荟多糖低、中、高剂量组、AT 组、对照组小鼠的甲状腺功能指标（每组n=10）

2.2 各组小鼠外周血的辅助型T 淋巴细胞频率比较

在芦荟多糖治疗4 周后，与对照组比较，AT组、芦荟多糖低、中、高剂量组小鼠外周血的CD3+CD8+IL-4+辅助T 淋巴细胞及CD3+CD8+IFN-γ+辅助T 淋巴细胞水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与AT 组比较，芦荟多糖低、中、高剂量组小鼠外周血CD3+CD8+IL-4+辅助T 淋巴细胞及CD3+CD8+IFN-γ+辅助T 淋巴细胞水平降低（P＜0.05）。见表2。

表2 芦荟多糖低、中、高剂量组、AT 组、对照组小鼠外周血的辅助型T 淋巴细胞频率比较（%，每组n=10）

2.3 各组小鼠脾脏辅助型T 淋巴细胞频率比较

在芦荟多糖治疗4 周后，与对照组比较，AT组、芦荟多糖低、中、高剂量组小鼠脾脏组织的CD3+CD8+IL-4+辅助T 淋巴细胞及CD3+CD8+IFN-γ+辅助T 淋巴细胞水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与AT 组比较，芦荟多糖低、中、高剂量组小鼠脾脏组织的CD3+CD8+IL-4+辅助T 淋巴细胞及CD3+CD8+IFN-γ+辅助T 淋巴细胞水平降低（P＜0.05）。见表3。

表3 芦荟多糖低、中、高剂量组、AT 组、对照组小鼠脾脏辅助型T 淋巴细胞频率比较（%，每组n=10）

3 讨论

AT 又称为淋巴性甲状腺炎，目前临床研究表明环境因素及遗传因素是导致AT 发病的主要原因，但其发病机制暂不明确［10］。相关文献显示［11-12］，目前我国有超过2 亿的甲状腺疾病患者，AT 患病率占总人群的1%～2%，AT 发病机制复杂，且缺乏有效的治疗方法和药物。本研究通过采取猪甲状腺球蛋白联合过量碘诱导产生AT 小鼠模型。本研究采用芦荟多糖分高、中、低剂量3 组小鼠进行4 周的连续治疗，并采用生理盐水同期灌喂AT 组及对照组，在甲状腺功能检测及辅助型T 细胞亚群检测中发现芦荟多糖高、中、低组较AT 组血清TSH、FT3、FT4 均有明显改善，且芦荟多糖高、中、低组的CD3+CD8+IL-4+辅助T 淋巴细胞及CD3+CD8+IFN-γ+辅助T 淋巴细胞水平较AT 组也有明显降低。

多种报道显示［13-14］，芦荟多糖主要由半乳糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖及甘露糖组成，除抗烫伤、抗辐射等外，目前还发现可保肝、降糖及抗突变、艾滋病防治等新的药理作用。国内学者表明［15］芦荟多糖可通过调整Th1/Th2 细胞因子的水平而达到调节机体的免疫抑制作用。机体内，辅助型T 淋巴细胞主要分为Th1、Th2、Th17、Thαβ 辅助细胞，临床资料表明［16-17］，Th1 辅助细胞主要参与细菌及原虫的免疫反应，由IL-12 驱动，而Th2 辅助细胞主要为对抗细胞外的细胞寄生虫的免疫反应，由IL-4 驱动。辅助T 淋巴细胞分化主要受机体的细胞因子的种类及水平所调控，且不同的T 细胞类型也会反过来影响其他细胞因子的分泌。本研究中芦荟多糖可降低AT 小鼠的TSH 水平，同时升高FT3、FT4 的水平，且随着芦荟多糖的剂量增加，改善越明显，说明芦荟多糖可明显改善小鼠的甲状腺功能，缓解其症状。同时进一步分析小鼠外周血及脾脏组织时，发现芦荟多糖可明显降低AT 小鼠的CD3+CD8+IL-4+辅助T 淋巴细胞及CD3+CD8+IFN-γ+辅助T 淋巴细胞水平，且随着芦荟多糖的剂量增加外周血及脾脏组织的 CD3+CD8+IL - 4+辅助 T 淋巴细胞及CD3+CD8+IFN-γ+辅助T 淋巴细胞水平下调越多，表明芦荟多糖可通过调控CD3+CD8+IL-4+辅助T 淋巴细胞及CD3+CD8+IFN-γ+辅助T 淋巴细胞水平进而降低IL-4 和IFN-γ 的分泌，缓解小鼠自身免疫反应。

CD3 是T 淋巴细胞的表面标记物，CD4 和CD8则是T 淋巴细胞的亚群。CD4+T 淋巴细胞被称为辅助性T 淋巴细胞，可以识别和激活其他免疫细胞来对抗感染和肿瘤。而CD8+T 淋巴细胞被称为细胞毒性T 细胞，可以直接杀死感染细胞和肿瘤细胞。IL-2R 是细胞因子IL-2 的受体，在T 细胞激活和增殖过程中起到重要作用。在甲状腺炎的早期，CD4+T 淋巴细胞和IL-2R 的水平通常升高，而CD8+T 淋巴细胞的水平相对较低。这反映了体内的免疫应答正在发生，而CD4+T 淋巴细胞在这个过程中扮演了重要角色。在疾病进一步发展时，CD8+T 淋巴细胞的活性可能会增强，同时CD4+T淋巴细胞的水平可能会下降。这反映了体内炎症反应的进一步加重和对甲状腺组织的破坏。芦荟多糖可能通过不同机制调节这些免疫指标的表达，从而影响AT 小鼠的免疫反应。研究表明［18］，芦荟多糖可能通过减少炎症介质的释放，降低CD4+T 淋巴细胞的活性，并促进CD8+T 淋巴细胞的活性，从而减少对甲状腺组织的破坏。

综上所述，在过量碘及猪甲状腺球蛋白联合诱导下建立的AT 小鼠模型，发现芦荟多糖可有效改善AT 小鼠的甲状腺功能，同时降低辅助型T 细胞亚群水平以抑制AT 小鼠机体内的免疫反应。需要指出的是本研究仅对动物模型进行相关研究，受客观条件约束未对具体的分子机制进行研究，后续应开展多中心研究，为AT 的治疗提供更有效的实验数据。