基于网络药理学探讨槐角丸治疗痔疮的作用机制

刘婉婷 胡子毅

（1.江西中医药大学研究生院，江西 南昌 330006；2.江西中医药大学附属医院中医经典科，江西 南昌 330006）

痔疮临床表现为各种程度便血、肛门肿大、肛门疼痛等症状，且易重复发病［1］。2013 年—2014 年底，江维等［2］调查显示，城市居民肛肠疾病发病率最高的是痔，占肛肠科发病率98.92%。据俞婷等［3］2017 年—2018 年于上海市金山医院肛肠科调查，采用随机抽样以及调查问卷形式，共回收的1477 份合格调查问卷，其中有1080 份显示被调查对象患有痔病，痔疮患病率73.12%。

目前，西医学对痔疮病因病机的阐述尚无统一标准，大家普遍认可的机制可能为肛垫下移、血管增生、痔病退变以及静脉曲张等［4-6］。中医学则认为痔疮的病因病机是外感六淫、过饥过饱或饥饱无常，致气血亏少，使局部气血结滞、筋脉纠结逆乱［4］。槐角丸出自《太平惠民和剂局方》，具有清肠疏风、祛湿止痒、凉血消肿之功效［7］。文章运用网络药理学方法探索槐角丸治疗痔疮的作用机制，为槐角丸的临床应用提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 槐角丸活性成分的获取及靶点的筛选在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库中，以槐角、地榆、当归、防风、枳壳、黄芩为关键词，限制口服吸收利用度（OB）≥30%和药物相似性（DL）≥0.18，对槐角丸的主要成分进行检测。然后再利用Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）检索并设定人源（Human），进一步将获取的蛋白质靶点信息转换为相应的基因名称，从而获得了与活性成分相对应的蛋白质靶点。

1.2 痔疮靶点筛选以“Hemorrhoids”为关键词，从GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库和Drug-Bank（https：//go.drugbank.com）数据库中获取痔疮的基因符号（Gene Symbol），并将结果保存。

1.3 网络构建与分析将获取到的药物靶点与疾病靶点取交集，并导入String 数据库（https：//cn.string-db.org），构建PPI网络。设定物种为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为“medium confidence”（0.400），其余参数不变。用Cytoscape 3.9.1 软件中的CytoHubba 插件，依据马修斯相关系数（MCC）得分，选取得分排名前10位的基因作为核心（Hub）基因。

1.4 京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集通路分析与基因本体论（GO）分类富集分析利用仙桃学术（https：//www.xiantaozi.com/）在线网站中的高级生信工具，对药物与疾病的交集基因进行富集分析。

2 结果

2.1 活性成分筛选及靶点筛选使用TCMSP 数据库，槐角丸共获取到58 个活性成分，预测靶点1270 个。见表1。预测靶点去重后，获得247个靶点。

表1 槐角丸“中药-活性成分-预测靶点”信息

2.2 疾病靶点筛选结果使用GeneCards 数据库检索，获得痔疮疾病基因577 个，使用DrugBank 数据库检索，获得痔疮疾病基因132 个。剔除重复基因后，最终得到641个痔疮疾病基因。

2.3 网络构建与结果分析将所有得到的药物靶点与疾病靶点进行映射，得到54个共有靶点。将交集靶点导入String 数据库构建PPI 网络。见图1。MCC 得分从高到低依次是白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、表皮生长因子受体（EGFR）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、纤连蛋白1（FN1）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、趋化因子8（CXCL8）、白细胞介素-1β（IL-1β）。

图1 槐角丸治疗痔疮的PPI网络图

2.4 KEGG富集通路分析与GO分类富集分析KEGG通路富集分析找到123 条信号通路，主要包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信号通路、核因子κB（NF-κB）信号通路、白细胞介素-17（IL-17）信号通路等。剔除与疾病不相关的通路，按照富集基因的个数从多到少依次排序，选取前20条作图。见图2。

图2 槐角丸治疗痔疮的KEGG通路富集分析柱状图

GO 富集分析共有2308 条，包括生物过程（BP）2179条，细胞组成（CC）35条和分子功能（MF）94条。按照其基因富集个数从高到低依次排序，各选取前10条作图。见图3。

图3 槐角丸治疗痔疮的GO富集分析柱状图

涉及BP 的有活性氧代谢过程（18 个）、脂多糖（16个）、活性氧代谢过程的调节（14 个）、细胞外结构组织（14个）、上皮细胞增殖（14个）、氧化应激反应（14个）等；涉及CC 的有膜筏（11 个）、膜微区（11 个）、膜区域（11 个）、内质网腔（7 个）、质膜筏（5 个）、线粒体外膜（5个）、细胞器外膜（5个）等；涉及MF的主要有受体配体活性（9个）、细胞因子活性（8个）、肽链内切酶活性（8 个）、热休克蛋白结合（7 个）、蛋白酶结合（7个）、血红素结合（7个）等。

3 讨论

槐角丸主要应用于肛肠科疾病，且疗效确切。此方槐角用量最重，研究［8，9］表明，槐角黄酮中所含的槲皮素、黄芩苷、山柰酚等多种小分子物质还能帮助降低毛细血管系统的通透性和脆性，增加稳定性，具有明显的抗炎、抗肠道溃疡、止血和凝血等功能。地榆味苦性寒，药理实验证明，地榆具有明显的止血［10］、抗炎消肿［11］、改善血液系统、抗肿瘤［12］等作用。黄芩能增强槐角的清肝凉血的功效，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等作用［13］。虽然下血是因为热迫血液下行，但也有气机下陷的原因。因而稍佐有升发作用的防风、枳壳升举气机。药理实验［14］证明，枳壳能够增强肠胃收缩力、降低血管脆性，能够达到压迫止血的目的。当归补血活血、润肠通便。马艳春等［15］研究证实，当归具有抗炎、抗肿瘤、调节造血功能等效果。

根据MCC 算法筛选出得分高的前10 个关键靶点，分值从高到低依次是IL-6、TNF、VEGFA、PTGS2、EGFR、MMP9、FN1、MMP2、CXCL8、IL-1β。其 中IL-6 和IL-1β 属白细胞介素，二者均可与TNF 协同诱导VEGF 使血管生成活性和血管通透性增加［16］。CXCL8 是α 型趋化因子，在未受刺激的细胞中几乎检测不到CXCL8。CXCL8-趋化因子受体（CXCR）1/2 轴还通过NF-κB 通路诱导内皮细胞中VEGF 的转录来刺激VEGFR2 活化，CXCL8-CXCR2 轴还可反式激活EGFR，从而介导毛细血管形成［17］。实验研究［18］表明，痔疮组织血管内皮细胞内VEGFA表达明显高于正常组织血管内皮细胞。杨奕婷等［19］研究发现，痔疮组织的新血管生成可能与VEGF 和碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）的过度表达有关，且会随着病情的加重而升高。PTGS2是非甾体抗炎药（NSAID）的靶标，当机体发生炎症时，PTGS2 会大量合成，从而促使前列腺素的合成，从而介导对生理压力（如感染和炎症）的反应［20，21］。EGFR 分子及其相关信号通路可以直接对各种表皮细胞生长、增殖及分裂过程和细胞诱导及分化凋亡过程等细胞生理活性反应发挥重要的作用。MMP9、MMP2均属于基质金属蛋白酶，冯大勇等［22］研究发现，相比于正常组织，痔组织中的MMP-9 的表达率更高，MMP-2 则无较大差异。并且，在伴有血栓形成等并发症的痔组织［23］中MMP-9表达明显增高。FN1 参与细胞黏附、细胞运动、调理作用、伤口愈合和细胞形状的维持［24］。

本项研究主要通过对KEGG 通路进行富集和分析，一共找到了123 条通路。数据研究［25］表明，NF-κB 诱导激酶在肠上皮细胞中由IL-17、TNF-α和IL-1β触发的NF-κB 信号级联中充当共同介质。此外，有研究［26］显示成人神经干细胞通过TNF-α 受体信号传导被系统性炎症警报。PI3K-Akt 信号通路是一个从细胞膜向细胞核传导的通路，活化的PKB（Akt）可直接作用于前体凋亡蛋白，进而阻止细胞死亡、促进细胞存活［27］。汪元等［28］研究发现，缺氧诱导因子-1（HIF-1）可通过激活VEGF转录，进而对PI3K-Akt进行调节，从而促进大鼠滑膜血管的新生。曹立睿［29］研究表明，山柰酚可以通过作用于HIF-1 信号通路、PI3K-Akt 信息通路等来减少细胞氧化破坏，并控制炎症反应。

综上所述，槐角丸可能是通过作用于IL-6、MMP2、VEGFA 等54 个靶点，抑制PI3K-Akt、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路，从而起到清热凉血、消肿止痛的功效。本研究主要依赖于网络，且目前国内对于槐角丸治疗痔疮的研究较少，仍需进一步实验验证。