复方当归注射液对牛蛙坐骨神经- 腓肠肌活动的影响研究

2023-10-10张云博刘雨娟

卫生职业教育 2023年19期

张云博，刘雨娟

（河西学院医学院，甘肃张掖 734000）

肌肉和运动神经纤维，通过研究电流刺激参数和骨骼肌收缩反应的关系，为临床治疗肌萎缩及运动神经纤维损伤提供实验理论依据[3-4]。制备牛蛙离体腓肠肌标本的手术操作步骤简单，室温条件下用任氏液防止组织干燥就能保持其兴奋性。因此，本文以牛蛙离体坐骨神经- 腓肠肌标本为研究对象，观察在不同强度、频率的电流刺激下，复方当归注射液对牛蛙离体腓肠肌收缩活动和兴奋性的影响，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年牛蛙12 只，雌雄不限，体重（500+50）g，由张掖市誉诚医药生物科技有限公司提供。

1.2 试剂与仪器

复方当归注射液（规格为2 mL），由福建古田药业有限公司提供；新鲜任氏液，由河西学院医学院生理实验室配制；BL- 420F 生物信息采集分析系统、张力传感器、神经屏蔽盒等，均由成都泰盟科技有限公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 双毁髓法[1]制备坐骨神经- 腓肠肌标本将牛蛙固定于蛙板上，杀蛙针通过枕骨大孔垂直进针，斜向上水平捣毁脑组织，再向下垂直捣毁脊髓。通过检查四肢肌张力是否消失判断脑和脊髓的破坏程度，当牛蛙处于脑死亡状态后，用粗剪刀剪除头部、躯干上肢和内脏组织，剥除皮肤组织。将蛙从脊髓中央分离成两半，一半浸泡在任氏液中备用，另一半用蛙足钉将两端固定在木质蛙板上继续分离。向上保留与坐骨神经相连的一段脊柱，向下沿坐骨神经干走向用玻璃分针分离周围组织，剪去其侧肢保留主干结构完整，在膝关节上部留取约3 cm 的股骨，剪去膝关节以下的后肢，以玻璃分针游离腓肠肌，用丝线结扎跟腱处后将其剪断。实验过程中不断将任氏液滴在坐骨神经干和腓肠肌上，防止组织干燥。

1.3.2 坐骨神经- 腓肠肌标本兴奋性检查标本制备好后，用锌铜弓检查其反应，保证兴奋性良好。

1.3.3 数据采集与记录将坐骨神经- 腓肠肌标本的股骨端固定在神经屏蔽盒中，另一端用细线连接在张力传感器上；将脊柱段放入神经屏蔽盒，坐骨神经干搭在刺激电极上。连接BL- 420F 生物信息采集分析系统，选择生理学实验—神经肌肉实验—刺激强度与骨骼肌收缩张力的关系、刺激频率与骨骼肌收缩形式的关系。用直流电刺激坐骨神经干，在CH1 通道，波宽0.1 ms，分别记录不同刺激强度（刺激频率为1 Hz、初始刺激强度为0.040 V、增益为0.002 V）和不同刺激频率下（刺激强度为1 V，初始刺激频率为1 Hz、增益为1 Hz），腓肠肌发生收缩活动时的波形。

1.3.4 给药方法待波形稳定后，先滴加5%复方当归注射液0.1 mL，记录给药前后波形的变化；给标本滴加任氏液0.2 mL，静置20min，待波形恢复正常后，滴加0.2 mL维拉帕米（10-5mol·L-1），5 min 后再滴加0.2 mL 复方当归注射液，记录波形的变化。

1.4 数据分析

采用SPSS 23.0 软件对数据进行处理，采用t 检验分析给药前后骨骼肌收缩张力的变化，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 滴加复方当归注射液后，腓肠肌发生单收缩活动时刺激强度的变化

与给药前相比，在刺激频率保持1 Hz 不变的情况下，逐渐增加电流刺激强度（增益为0.002 V），复方当归注射液可降低使腓肠肌单收缩时的阈强度、半高刺激强度、最适刺激强度，且差异具有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），使腓肠肌单收缩时的最大收缩张力、最小收缩张力、平均收缩张力升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。由此可见，复方当归注射液可降低腓肠肌发生反应的阈强度，提高其发生单收缩反应的兴奋性，也能增强其单收缩时的最大、最小收缩张力（见表1、图1、表2、图2）。

图2 给药10 min 后刺激强度与腓肠肌单收缩张力的变化曲线Figure 2 Change curve of stimulation intensity and single contraction tension of gastrocnemius muscle 10 minutes after administration

表1 复方当归注射液对刺激强度与腓肠肌单收缩关系的影响（±s）单位：VTable 1 Effect of compound angelica sinensis injection on the relationship between stimulation intensity and single contraction of gastrocnemius muscle（±s） Unit：V

注：与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

最适刺激强度0.076±0.030 0.068±0.020*时间阈强度0.060±0.004 0.044±0.002**给药前给药10 min 后半高刺激强度0.068±0.040 0.054±0.030**

表2 复方当归注射液对腓肠肌单收缩张力的影响（±s）单位：gTable 2 Effect of Compound angelica sinensis injection on single contraction tension of gastrocnemius muscle（±s）Unit：g

注：与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

平均收缩张力7.98±0.56 12.98±0.74**时间最大收缩张力45.18±1.56 50.36±1.03*给药前给药10 min 后最小收缩张力6.65±0.32 11.10±0.49**

2.2 复方当归注射液对腓肠肌强直收缩的影响

与给药前相比，在刺激强度为1 V、逐渐增加电流刺激频率（增益为1 Hz）的情况下，复方当归注射液能降低腓肠肌发生不完全强直收缩和完全强直收缩时所需的刺激频率（P＜0.05），增加腓肠肌完全强直收缩过程中的最大收缩张力和最小收缩张力（P＜0.01），见图3、图4、表3。

图3 给药前刺激频率与腓肠肌收缩形式的变化曲线Figure 3 Curve of change of stimulation frequency and contraction form of gastrocnemius muscle before administration

图4 复方当归注射液对腓肠肌收缩形式的影响Figure 4 Effect of compound angelica sinensis injection on the contraction form of gastrocnemius muscle

表3 复方当归注射液对腓肠肌收缩形式的影响（±s）Table 3 Effect of compound angelica sinensis injection on the contraction form of gastrocnemius muscle（±s）

注：与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

完全强直收缩时最小收缩张力/g 9.45±0.48 20.99±0.98**时间完全强直收缩时的刺激频率/Hz 20.00±1.89 16.00±0.68*给药前给药10 min 后不完全强直收缩时的刺激频率/Hz 6.00±0.49 3.00±0.16*完全强直收缩时最大收缩张力/g 130.23±2.89 189.26±3.16**

2.3 维拉帕米+复方当归注射液对腓肠肌单收缩活动的影响

腓肠肌发生单收缩时，维拉帕米可阻断复方当归注射液增强腓肠肌完全强直收缩时最大、最小和平均收缩张力的效应（P＜0.05），但对复方当归注射液下调腓肠肌发生完全强直收缩时所需的刺激频率的效应无阻断作用，见图5、表4。

图5 维拉帕米+复方当归注射液对腓肠肌完全强直收缩时张力的影响Figure 5 The effect of Verapamil+compound angelica sinensis injection on the tension of gastrocnemius muscle during complete tetanic contraction

表4 维拉帕米+复方当归注射液对腓肠肌收缩形式的影响（±s）Table 4 Effect of Verapamil+compound angelica sinensis injection on contraction form of gastrocnemius muscle（±s）

注：与滴加复方当归注射液10 min 后比较，*P＜0.05。

滴加复方当归注射液10 min 后维拉帕米+ 复方当归注射液不完全强直收缩时的刺激频率/Hz 3.00±0.16 4.00±0.16完全强直收缩时的刺激频率/Hz 16.00±0.68 15.00±0.56完全强直收缩时最大收缩张力/g 189.26±3.16 145.18±3.76*完全强直收缩时最小收缩张力/g 20.99±0.98 15.92±0.89*

2.4 琥珀胆碱+复方当归注射液对腓肠肌单收缩活动的影响

在腓肠肌单收缩反应良好的情况下，加入琥珀胆碱3 min后，收缩反应波形消失变为直线，肉眼观察腓肠肌无收缩活动。此时，加入复方当归注射液，10 min 后，刺激反应波形依然是平直状态，说明琥珀胆碱可阻断复方当归注射液对离体坐骨神经-腓肠肌收缩活动的作用，见图6。

图6 琥珀胆碱+复方当归注射液对腓肠肌收缩张力的影响Figure 6 The effect of suxamethonium chloride+compound angelica sinensis injection on the contractile tension of gastrocnemius muscle

2.5 乙酰胆碱（Ach）+复方当归注射液对腓肠肌单收缩活动的影响

与单纯给Ach 相比，Ach+复方当归注射液可下调腓肠肌收缩反应的阈值，降低最适刺激强度（P＜0.05）。由此可见，Ach 与复方当归注射液对腓肠肌发生收缩反应的阈强度和最适刺激强度的影响有协同效应，见表5、图7、图8。

图7 Ach 对腓肠肌收缩活动的影响Figure 7 Effect of Ach on contractile activity of gastrocnemius muscle

图8 Ach+复方当归注射液对腓肠肌收缩的影响Figure 8 Effect of Ach+compound angelica sinensis injection on contraction of gastrocnemius muscle

表5 Ach 和复方当归注射液对刺激强度的影响单位：mVTable 5 Ach and the effect of compound angelica sinensis injection on stimulation intensityUnit：mV

2.6 复方当归注射液对坐骨神经干产生动作电位的阈强度的影响

与给药前相比，在波宽1 ms、延时21 ms 的情况下，给予坐骨神经起始为0.1 mV 的电流刺激（增益为0.1 mV），与给药前相比，复方当归注射液可下调坐骨神经干产生动作电位的阈强度，差异有统计学意义（P＜0.05）。阈值是衡量兴奋性的指标，其大小与兴奋性呈反比。由此可见，复方当归注射液能提高坐骨神经干产生动作电位的兴奋性，见表6、图9、图10。

图9 给药前坐骨神经干产生动作电位的阈强度Figure 9 Threshold intensity of action potential produced by sciatic nerve trunk before administration

图10 复方当归注射液对坐骨神经干产生动作电位阈强度的影响变化曲线Figure 10 Change curve of influence of compound angelica sinensis injection on threshold intensity of action potential produced by sciatic nerve trunk

表6 复方当归注射液对坐骨神经干产生动作电位阈强度的影响（±s）Table 6 Effect of compound angelica sinensis injection on threshold intensity of action potential produced by sciatic nerve trunk（±s）

注：与给药前比较，*P＜0.05。

时间阈强度/ mV 1.10±0.08 0.80±0.05*给药前给药10 min 后

3 讨论

中医将肌无力归于“萎症”“虚劳”等范畴，认为其与脾、胃、肝、肾等脏腑功能失调有关，治疗主张滋补肝肾、强健筋骨、祛风通络、养心益气。临床常用复方当归注射液治疗椎间盘损伤、腰肌劳损、急性腰扭伤、增生性和强直性脊柱炎等，且取得较好效果。

3.1 复方当归注射液增强腓肠肌收缩的离子通道机制

毛启远等[5]研究发现，当归补血汤对小鼠心功能，尤其是处在收缩期的心肌组织有明显的保护作用。骨骼肌收缩过程中，会出现一个完整的收缩波曲线，包括潜伏期、收缩期和舒张期，细胞内Ca2+浓度开始下降时，进入舒张期[6]。目前公认的肌肉收缩机制为肌丝滑动原理，肌肉收缩主要与细胞内液Ca2+浓度升高有关，骨骼肌收缩时，大部分细胞内Ca2+来自肌细胞内质网，少部分Ca2+源于细胞外Ca2+内流[7]。骨骼肌收缩的形式与肌肉组织中收缩蛋白的数量和肌肉内部的生理状态变化密切相关，肌肉收缩舒张的速度、张力等也会随之改变[8]。研究表明，当归含有人体所需的17 种氨基酸和Na+、K+、Ca2+、Mg2+等20 余种无机物，这些离子物质与体内多种代谢活动及细胞兴奋性有关。本研究发现，复方当归注射液可以升高坐骨神经干兴奋性，腓肠肌发生单收缩、不完全强直收缩和完全强直收缩时的最大收缩张力、最小收缩张力；维拉帕米可以阻断复方当归注射液增强腓肠肌收缩张力的效应，可能与当归促进Ca2+内流，升高腓肠肌细胞内Ca2+浓度有关。

3.2 复方当归注射液可促进Ach 释放并促进其与N2 受体结合

坐骨神经支配腓肠肌收缩时，其接头处兴奋的传递过程需要电信号触发突触前膜的Ca2+通道，突触小泡前移释放Ach，Ach 与终板膜中N2 型Ach 受体结合产生终板电位，从而完成兴奋传递，随后Ach 被终板膜中胆碱酯酶水解[9]。琥珀胆碱属于去极化型非选择性N2 受体阻断剂，作用于运动神经终板膜以阻断神经- 骨骼肌接头处Ach 向骨骼肌传递信息的过程，使肌肉松弛。研究结果显示，琥珀胆碱可阻断复方当归注射液对腓肠肌单收缩活动的兴奋作用，而乙酰胆碱却能增强其对腓肠肌单收缩时阈值和最适刺激强度的影响效应，提高其兴奋性。由此可见，复方当归注射液可能通过触发突触前膜Ca2+通道开放，进而促进Ach 释放，促进Ach 与N2 受体结合，从而增强腓肠肌在电流刺激下发生单收缩反应的兴奋性和收缩张力。

3.3 复方当归注射液可增强大小运动单位的兴奋性

腓肠肌属于可兴奋组织。阈强度是指能够引起其发生收缩反应（腓肠肌细胞膜上产生动作电位）的最小刺激强度；最大刺激强度是指腓肠肌的收缩张力不会随着刺激强度的增加而逐渐升高的临界值；半高刺激强度是腓肠肌收缩张力达到最大收缩张力的1/2 时的刺激强度[10-11]。衡量可兴奋细胞、组织兴奋性的指标是阈强度，其与兴奋性呈反比[12]。骨骼肌发生收缩活动时遵循大小原则，即运动单位的动员是由小到大逐步逐级动员。这是因为小运动单位兴奋性高，首先被动员；大运动单位兴奋性低，只有当刺激强度足够大时，才能被动员[13]。腓肠肌组织内的运动单位为1 934 个，肌纤维为3 868 000 个。许培宏等[14]研究发现，间接刺激和直接刺激都可以引起腓肠肌收缩，但通过刺激神经间接引起肌肉收缩的效率更高（阈强度和最适刺激强度更小，而最大单收缩幅度更大），可能是因为间接刺激通过神经纤维末梢、以运动单位的形式可更方便地动员更多肌肉纤维参与收缩，因而更敏感，收缩力也更大。本研究结果显示，复方当归注射液可下调腓肠肌单收缩时的阈强度、半高刺激强度和最适刺激强度。由此可见，复方当归注射液可以通过降低电流刺激腓肠肌时发生收缩反应的阈值，增强其兴奋性，其机制可能与复方当归注射液能促进Ach 与骨骼肌细胞膜上N2 受体结合，促进神经- 骨骼肌接头结构处信息的传递，从而增强大小运动单位的兴奋性有关。

综上所述，复方当归注射液既可以通过增强坐骨神经干传导动作电位的能力，又可以提高腓肠肌兴奋性，使腓肠肌发生单收缩、不完全强直收缩和完全强直收缩的最大、最小收缩张力、平均收缩张力增加。但是，正常生理状态下，躯体的运动几乎都是以完全强直收缩的形式进行。由此可见，复方当归注射液在一定程度上可以有效缓解肌无力，其具体作用机制还需进一步研究。